吳 劍，曾凡坤，陳飛平

(西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715)

酸性水提取柑橘皮渣檸檬苦素工藝

吳 劍，曾凡坤*，陳飛平

(西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715)

以使用硫酸調(diào)節(jié)純水得到的酸性水為溶劑，采用高效液相色譜測定檸檬苦素含量，浸提柑橘皮渣中檸檬苦素。在熱浸提時間、溫度及料液比單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用三元二次旋轉(zhuǎn)組合試驗設(shè)計優(yōu)化提取條件，建立三因素與檸檬苦素得率之間的數(shù)學(xué)模型。結(jié)果表明，酸性水提取柑橘皮渣中檸檬苦素的最佳工藝條件為提取時間2.6h、溫度61.2℃、料水比1∶19.2(g/mL)、酸性水提取液pH4。在此工藝條件下，檸檬苦素的得率為0.117mg/g。

柑橘皮渣；檸檬苦素；提取；旋轉(zhuǎn)正交；高效液相色譜

檸檬苦素類似物的主要來源是蕓香科柑橘屬植物[1]，在幼果中多以苷元的形式存在。在果實的成長后期、成熟期檸檬苦素類似物苷元轉(zhuǎn)化為配糖體，這種配糖體化只在果實及種子中進行[2]。隨著果實不斷發(fā)育，苷元逐步轉(zhuǎn)化為配糖體[3]，在種子中配糖體含量占干質(zhì)量的0.31%～0.87%[4]。隨著對檸檬苦素類似物生物活性的認(rèn)識，檸檬苦素類似物的應(yīng)用研究已引起了醫(yī)學(xué)界和食品界的廣泛關(guān)注。檸檬苦素類似物在抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗病毒、抗菌、利尿、抗焦慮，并可以改善睡眠質(zhì)量、降低膽固醇含量、防止動脈粥樣硬化等方面都具有顯著效果[5-9]。

國內(nèi)對檸檬苦素進行系統(tǒng)性研究的為數(shù)不多，就已有的研究成果，大部分是以柑橘種子作為提取材料、有機溶劑作為提取溶劑。在柑橘加工過程中，皮渣(去汁后剩余物)是主要副產(chǎn)品，占柑橘總量的20%～40%[10-11]。如要從皮渣中分離種子和其他部分，進行大規(guī)模的生產(chǎn)顯然是不可行的。將鮮榨后的柑橘皮渣進行處理后，可以直接提取檸檬苦素或其他生物活性物質(zhì)，這將極大提高工業(yè)化生產(chǎn)的可行性。在水提取基礎(chǔ)上，根據(jù)檸檬苦素在酸性環(huán)境中可以增大其溶出率的原理，并且考慮提取溶劑的回收率與消耗成本，在以工業(yè)化為目標(biāo)的前提下，本實驗以新鮮柑橘皮渣作為提取材料、酸性水作為提取溶劑對其提取工藝進行研究并優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮柑橘(甜橙)榨汁后剩余皮渣，取自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所，粗碎備用。

1.2 試劑與儀器

檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.8%) 美國Simga公司；乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純) 天津四友公司。

ultimate XB-C18(4.6mm×250mm，5μm) 美國Welch公司；LC-20A型高效液相色譜儀、LC-20A型紫外檢測器、UV-2450型雙光束紫外分光光度計 日本島津公司；AE200型分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司；PH-3S型酸度計 成都方舟科技公司；JQS200DE型超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 高效液相色譜條件[12]

色譜柱：Welch ultimate (250mm×4.6mm，5μm)；流動相：乙睛-超純水(45∶55，V/V)；流速 1.0mL/min；柱溫25℃；檢測波長200nm；進樣量5μL。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與得率計算方法

稱取檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品6.7mg，用色譜純乙腈溶解并定容于25mL容量瓶，配制成質(zhì)量濃度0.0134mg/mL的檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)溶液，貯存于4℃?zhèn)溆?。?jīng)雙光束紫外分光光度計掃描后，確定最大吸收波長為200nm，此后實驗中檢測波長定為200nm。

精確量取1、2、3、4、5mL檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)母液置于5個10mL容量瓶，分別向各容量瓶中加乙腈稀釋并定容于10mL，制成一系列梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。經(jīng)0.45μm有機濾膜后以進樣量為5μL經(jīng)液相色譜分析檢測，記錄色譜圖，以峰面積為橫坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得曲線方程為Y=3×10-7X-0.0005(R2=0.9996)，檢出限為0.001～0.05mg/mL。

式中：c為經(jīng)過計算提取液中檸檬苦素的質(zhì)量濃度/ (mg/mL)；v為提取液的總體積/mL；m為取樣的質(zhì)量/g。

1.5 檸檬苦素提取工藝流程

柑橘皮渣粗碎→60～90℃石油醚脫脂→稱量→酸性水熱提取→過濾→高效液相色譜檢測

1.6 樣品檢測

稱取脫脂皮渣5.0g，加入酸性提取液，按提取工藝條件在熱水浴提取，過濾并收集濾液，取各組處理提取液2mL經(jīng)針式過濾頭(有機系，0.45μm)過濾后，裝入自動進樣瓶。按色譜條件自動進樣檢測，記錄色譜圖，計算色譜峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品濃度。對檸檬苦樣標(biāo)準(zhǔn)品與提取樣品進行檢測，結(jié)果見圖1?？梢钥闯鰳悠分袡幟士嗨乇Ａ魰r間與標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖中的保留時間一致，可以判斷為檸檬苦素。

圖1 檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品與樣品色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of limonin standard and sample

1.7 酸性水提取檸檬苦素單因素試驗設(shè)計

使用硫酸、鹽酸、醋酸、檸檬酸調(diào)節(jié)純水pH值，以相同pH值的純水作為提取溶劑，確定最高得率的溶劑；確定最佳提取溶劑后，進行單因素試驗，試驗水平為：pH2.5、3、3.5、4、4.5、5、10；提取時間0.5、1、2、3、4h；提取溫度20、40、50、60、70、80、90℃；料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶18、1∶20 (g/mL)，確定提取時間、溫度、料液比的最佳條件，提取液中檸檬苦素得率按1.2.5節(jié)方法測定并計算得率。試驗初始提取條件為溫度50℃、料液比1∶10、提取時間1.5h，此后完成一個最佳因素替換一個以此類推。1.8優(yōu)化試驗設(shè)計

以檸檬苦素得率為響應(yīng)值，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取酸性水提取時間、料液比以及提取溫度為影響因素，采用三元二次旋轉(zhuǎn)組合試驗設(shè)計[13]優(yōu)化試驗，確定提取效率最佳的組合條件。在三元二次旋轉(zhuǎn)組合試驗設(shè)計中，分別用X1、X2、X3依次表示料液比、提取溫度和提取時間，以γ、1、0、-1、-γ分別表示各因素的5個水平。根據(jù)SAS統(tǒng)計分析軟件設(shè)計試驗，試驗因素水平編碼設(shè)計見表1(以檸檬苦素得率為指標(biāo)評價提取效果)。

表1 三元二次旋轉(zhuǎn)組合試驗設(shè)計的因素水平編碼表Table 1 Factors and levels in the quadratic rotary unitization design

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種類酸性水對提取柑橘皮渣中檸檬苦素得率的影響

由圖2可知，在本體系中無機酸浸提檸檬苦素能力要強于有機酸。無機酸中硫酸提取得率高于鹽酸，推測在加熱情況下促進了鹽酸揮發(fā)速率，使得酸性水的酸性發(fā)生變化，而硫酸酸性水并不存在這個問題。并且硫酸使用廣泛并易得，符合試驗選擇常見廉價提取液藥品的原則，選擇硫酸做調(diào)節(jié)純水pH值的藥品。

圖2 不同酸性溶液對檸檬苦素提取得率的影響Fig.2 Effect of different acids on limonin yield

2.2 酸性水溶液pH值對提取柑橘皮渣中檸檬苦素得率的影響

圖3 不同pH值酸性水溶液對檸檬苦素提取得率的影響Fig.3 Effect of water pH on limonin yield

由圖3可知，提取溶劑pH2～4時，提取率相應(yīng)增加，pH4時提取率最大，之后隨著pH值增加，提取率下降，因此試驗中選擇pH4的酸性水溶液作為提取劑。

2.3 提取時間對提取柑橘皮渣中檸檬苦素得率的影響

圖4 提取時間對檸檬苦素得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on limonin yield

由圖4可知，提取時間不超過3h時，隨著時間的延長，檸檬苦素得率呈上升趨勢，超過2h后，基本趨于平緩；當(dāng)時間超過3h時，得率又下降，可能因熱處理時間過長，檸檬苦素被水中分子氧破壞所引起。綜合考慮得率及提取效率，試驗選取最佳提取時間為2.5h。

2.4 溫度對提取柑橘檸檬苦素得率的影響

應(yīng)該指出，對于軸瓦開有多槽形式，主要是考慮多槽在軸承圓周方向不同角度的布置對軸承工作性能的影響，本文的后續(xù)工作將陸續(xù)展開。

圖5 溫度對檸檬苦素得率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on limonin yield

從圖5可知，溫度在40～70℃之間時，隨著提取溫度的增加，檸檬苦素得率逐漸升高，溫度升高到60℃后，檸檬苦素的得率增長趨于平緩。檸檬苦素因其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，十分容易被氧化，在加熱條件下與水中氧分子碰撞結(jié)合的概率也相應(yīng)增加，溫度的升高有利于提高提取效率，但也會增加檸檬苦素被氧化的概率。檸檬苦素具有生物活性，提取溫度過高會破壞其化學(xué)結(jié)構(gòu)，因此選取60℃為最佳的提取溫度。

2.5 料液比對提取柑橘檸檬苦素得率的影響

圖6 料水比對檸檬苦素得率的影響Fig.6 Effect of solid-to-liquid ratio on limonin yield

由圖6可知，隨著加水量的增加，檸檬苦素得率逐漸升高，當(dāng)加水量大于取樣量15倍之后，得率變化不大。再增加加水量，反而使得率降低，可能提取溶液量多并且提取液中檸檬苦素濃度較低，在此濃度液相色譜檢測靈敏度下降，造成檸檬苦素得率下降的假象。因此綜合考慮溶劑用量與提取后濃縮純化工藝，選取1∶18為最佳料液比。

2.6 優(yōu)化試驗結(jié)果分析

優(yōu)化試驗結(jié)果見表2，以檸檬苦素得率為響應(yīng)值，采用SAS統(tǒng)計分析軟件進行多元回歸分析[14]，得到初步回歸方程為：Y=0.115164＋0.003039X1＋0.012984X2＋0.005412X3-0.019563X12-0.002125X1X2-0.000375X1X3-0.007896-0.001125X2X3-0.017265。

2.6.1 回歸模型分析

經(jīng)SAS進行多元回歸分析后，對回歸方程進行逐項顯著性評價，結(jié)果表明除X1X2、X1X3、X2X3項不顯著之外，其余各項均顯著，其中X2、、項達(dá)到極顯著。SAS軟件計算時，已將各項回歸系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化，因此根據(jù)3個因素的絕對值大小判斷影響因素的主次。在酸性水提取條件下，影響因素主次為溫度＞時間＞料液比。

對不顯著項利用SAS軟件中GLM Procedure逐步回歸，將不顯著項并入誤差項，得到優(yōu)化后的回歸方程：Y=0.115164＋0.003068X1＋0.012954X2＋0.005441X3-0.019553-0.007886-0.017255。R2值為95.81%，修正決定系數(shù)為92.91%，此二項表明試驗方法可靠，可以良好的描述試驗結(jié)果，可用于分析柑橘皮渣中檸檬苦素提取試驗。

表2 檸檬苦素提取旋轉(zhuǎn)組合試驗設(shè)計結(jié)構(gòu)矩陣及結(jié)果Table 2 Quadratic rotary unitization design and corresponding experimental results

2.6.2 方差分析

試驗結(jié)果方差分析見表3。結(jié)果表明P＜0.0001，回歸方程模型達(dá)到極顯著水平，而誤差項不顯著。因此，該回歸方程擬合性好。一次項與二次項對檸檬苦素提取得率有極顯著影響，交互項對檸檬苦素得率影響不明顯，有95.81%的響應(yīng)值變化來源于所選變量。

表3 方差分析結(jié)果表Table 3 Primary variance analysis for the established regression model

經(jīng)過GLM Procedure逐步回歸后的方差分析結(jié)果見表4。結(jié)果顯示經(jīng)過合并不顯著項后，回歸模型為極顯著。

表4 GLM回歸分析優(yōu)化后模型的方差分析Table 4 Variance analysis for the established regression model after GLM Procedure regression

圖7 各兩因素交互作用對檸檬苦素得率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots showing effects of pH, extraction time and temperature on limonin yield

從圖7響應(yīng)面圖與等高線圖所可看出，在其中一項固定為0水平時，另外二項的增加都會使得檸檬苦素得率先升后降，并達(dá)到最高值。當(dāng)提取時間和料水比各自固定為0水平時，檸檬苦素得率隨提取溫度的變化幅度較大，并且得率達(dá)到極大值。而得率隨著提取時間與料水比的變化時幅度不及溫度，提取溫度的改變對得率影響較大。利用SAS軟件中RSREG程序處理后得到3個因素的最優(yōu)值分別為提取時間2.6h、溫度61.2℃、料液比1∶19.2(g/mL)以及酸性水提取液pH4。在此條件下，預(yù)測檸檬苦素得率響應(yīng)值為0.120mg/g。

2.6.3 驗證實驗

以最優(yōu)條件作為一組處理進行驗證實驗，重復(fù)3次，得到的檸檬苦素平均得率為0.117mg/g，與理論預(yù)測值接近，重復(fù)性好。經(jīng)過試驗設(shè)計優(yōu)化后得到的提取條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實際價值。

3 結(jié)論與討論

本實驗將酸性水提取法與響應(yīng)面分析法結(jié)合，采用新鮮柑橘皮渣為原料，以硫酸溶液調(diào)節(jié)純水pH值至4為提取溶劑，并優(yōu)化了柑橘皮渣中檸檬苦素的提取工藝條件。經(jīng)優(yōu)化后的酸性水提取柑橘皮渣中檸檬苦素的最佳提取條件為提取時間2.6h、溫度61.2℃、料水比1∶19.2 (g/mL)以及酸性水提取液pH4。在此條件下，檸檬苦素得率為0.117mg/g。與前人研究使用乙醇提取柑橘果皮和種子中含檸檬苦素64mg/kg和200～300mg/kg(本實驗中皮渣中既有種子也有果皮)結(jié)果[15]基本符合。因使用硫酸調(diào)節(jié)純水pH值，與有機溶劑相比價格低廉，提取效果較好，提取液的酸較弱，除污簡單，污染環(huán)境可能性小，對工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)有指導(dǎo)意義。柑橘皮渣中水溶性物質(zhì)較多，在提取液中雜質(zhì)含量也較高，如何在提取后將雜質(zhì)去除，是今后需重點關(guān)注與研究的方向。

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Process Optimization for Acidic Water Extraction of Limonin from Citrus Peels by Response Surface Methodology

WU Jian，ZENG Fan-kun*，CHEN Fei-ping (College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

The pH of pure water was adjusted with sulfuric acid to provide a solvent for the extraction of limonin from citrus peels. Limonin quantification was performed by HPLC. Based on one-factor-at-a-time experiments, a three-variable quadratic rotary unitization design combined with response surface methodology was used to optimize three conditions for acidic water extraction of limonin from citrus peels, and a mathematical model describing limonin yield versus the three extraction conditions was built. The optimal extraction conditions of limonin from citrus peels were 2.6 h extraction at 61.2 ℃, pH 4 and a solid-toliquid ratio 1∶19.2 (g/mL). Under the optimized conditions, a limonin yield of 0.117 mg/g was achieved.

citrus peels；limonin；extraction；quadratic rotary unitization design；high performance liquid chromatography

TS209

A

1002-6630(2011)14-0006-05

2010-07-23

“十一五”國家科技支撐計劃項目(2007BAD47B06-4)

吳劍 (1985—)，男，碩士研究生，研究方向為食品工程。E-mail：wj851031@yahoo.com.cn

*通信作者：曾凡坤(1963—)，男，教授，研究方向為果蔬加工。E-mail：zengfankun@swu.edu.cn