張 偉，姚 俊*，陳寬婷，孫榮斌，魏欽俊，曹 新

(1.南京醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)系，江蘇 南京 210029；2.江蘇省常熟職業(yè)教育中心校旅游管理系，江蘇 常熟215500；3.南京醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210029)

低能離子注入法選育透明質(zhì)酸高產(chǎn)菌株

張 偉1,2，姚 俊1,*，陳寬婷1，孫榮斌3，魏欽俊1，曹 新1

(1.南京醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)系，江蘇 南京 210029；2.江蘇省常熟職業(yè)教育中心校旅游管理系，江蘇 常熟215500；3.南京醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210029)

以一株獸疫鏈球菌(Streptococcus zooepidemicus) NN-7為出發(fā)菌株，利用30keV，劑量為8×1014N+/cm2氮離子進(jìn)行誘變，篩選獲得溶血素和透明質(zhì)酸酶雙缺陷型突變菌株，經(jīng)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)篩選獲得一株透明質(zhì)酸高產(chǎn)菌株SH-9，透明質(zhì)酸產(chǎn)量達(dá)3.23g/L，相對(duì)分子質(zhì)量達(dá)2.12×106，相對(duì)于原始菌株，透明質(zhì)酸產(chǎn)量及相對(duì)分子質(zhì)量分別提高了104.4%及35.9%。6代傳代實(shí)驗(yàn)表明誘變后得到的高產(chǎn)透明質(zhì)酸菌株具有較好的傳代穩(wěn)定性。低能離子注入法可作為有效的誘變手段用于透明質(zhì)酸高產(chǎn)菌株的選育。

透明質(zhì)酸；獸疫鏈球菌；離子注入；誘變選育

透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)是由β-D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D-氨基葡萄糖交替聚合而成的酸性黏多糖，相對(duì)分子質(zhì)量在2×105～7×106之間[1]。HA獨(dú)特的線性分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，使其具有良好的水溶性、吸水性、生物黏附性、生物相溶性、生物降解性，在工農(nóng)業(yè)、食品與醫(yī)藥等領(lǐng)域極具應(yīng)用潛力[2-5]。HA廣泛存在于脊椎動(dòng)物的結(jié)締組織如公雞雞冠、臍帶、眼睛的玻璃體液和皮膚中，同時(shí)也存在于鏈球菌的莢膜中[2]。微生物發(fā)酵法是大量獲得HA的主要途徑，目前篩選的HA合成菌大多是鏈球菌屬的A群和C群，均為β溶血型，產(chǎn)HA也產(chǎn)透明質(zhì)酸酶，為克服原菌株的不利因素，一般需進(jìn)行育種處理才能獲得溶血素和透明質(zhì)酸酶雙缺陷的HA高產(chǎn)菌株[6]。誘變劑育種由于方法簡便、突變率高、成本低廉，而廣泛用于HA合成菌的育種中，采用的誘變劑主要有紫外線、60Co、LiCl、硫酸二乙酯(DES)和亞硝基胍(NTG)等物理或化學(xué)誘變劑[7-9]。

近年來，離子注入技術(shù)逐漸從物質(zhì)的表面修飾發(fā)展成為一種新型的生物物理誘變手段，具有以較小的生理損傷而得到較高的突變率、較廣的突變譜的優(yōu)點(diǎn)，在優(yōu)良菌株的篩選、誘變效率的提高以及離子束介導(dǎo)外源基因的轉(zhuǎn)入等方面發(fā)揮了重要的作用[10-12]。目前在HA產(chǎn)生菌株的誘變育種中應(yīng)用低能離子注入的方式還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以獸疫鏈球菌(Streptococcus zooepidemicus NN-7)為出發(fā)菌株，采用30keV氮離子注入法進(jìn)行誘變，篩選HA高產(chǎn)菌株。

1 材料與方法

1.1 材料、培養(yǎng)基與儀器

獸疫鏈球菌(Streptococcus zooepidemicus NN-7)由南京醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保藏。

馬丁肉湯培養(yǎng)基(g/L)：馬丁肉湯 20、蛋白胨 5、NaCl 3、NaHCO32、Na2HPO41、葡萄糖 10、瓊脂20， pH7.6；發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 30、胰蛋白胨25、MgSO4·7H2O 10、MnSO40.6、K2HPO410、KH2PO410、(NH4)2SO40.6，pH7.6；篩選培養(yǎng)基：血瓊脂平板用于非溶血性菌株篩選，在馬丁肉湯培養(yǎng)基中加入10%脫纖維羊血；透明質(zhì)酸平板用于透明質(zhì)酸酶缺陷型菌株篩選，在馬丁肉湯培養(yǎng)基中加入0.1%的透明質(zhì)酸鈉。

LZD900多功能離子注入機(jī) 核工業(yè)部西南物理研究院。

1.2 方法

1.2.1 誘變方法

無菌條件下挑取獸疫鏈球菌NN-7在生理鹽水中懸浮，制成菌懸液，稀釋涂布于直徑為9cm的空平皿中心，使菌液形成一薄層；無菌風(fēng)干后采用不同劑量的氮離子注入(能量30keV)進(jìn)行輻照；輻照后用無菌棉球洗擦平皿菌層，將帶菌棉球放入裝有玻璃珠的無菌水試管中振蕩，逐級(jí)10倍稀釋后涂布于血瓊脂平板培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.2 初篩方法

血溶素缺陷型：原始菌株NN-7經(jīng)低能離子誘變后，在血瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)48h，用無菌牙簽挑取無溶血性的菌落接種于馬丁肉湯斜面培養(yǎng)基保存。

透明質(zhì)酸酶缺陷型：血溶性缺陷型菌株經(jīng)低能離子誘變后(操作同1.2.1節(jié))，將存活菌株接種到含透明質(zhì)酸鈉的篩選培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)16h后噴灑1%十六烷基吡啶溶液，用無菌牙簽挑取長勢(shì)好且無混濁圈的菌落接種于馬丁肉湯斜面培養(yǎng)基保存。

1.2.3 復(fù)篩方法

取初篩保藏的斜面，用接種環(huán)接一環(huán)菌于裝有50mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于37℃、250r/min發(fā)酵培養(yǎng)44h后測定HA產(chǎn)量及相對(duì)分子質(zhì)量。

1.3 指標(biāo)測定方法

1.3.1 HA含量的測定

將發(fā)酵液以4000r/min離心20min，取上清液1mL，加入2.5倍體積無水乙醇，混勻后置4℃冰箱中保存1h，離心收集沉淀，加入5mL蒸餾水稀釋沉淀，采用Bitter-Muir咔唑法測定HA的含量[13]。

1.3.2 HA相對(duì)分子質(zhì)量的測定

以0.2mol/L NaCl溶液為參比液，采用毛細(xì)管內(nèi)徑0.6mm的烏氏黏度計(jì)于25℃測定HA溶液的黏度，并計(jì)算其特性黏度值，再根據(jù)公式[η]=3.6×10-4Mr0.78(式中：[η]為特性黏度；Mr為相對(duì)分子質(zhì)量)計(jì)算出HA的相對(duì)分子質(zhì)量[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 離子注入劑量的選擇

采用不同氮離子劑量誘變處理獸疫鏈球菌NN-7，方法如1.2.1節(jié)所述，考察氮離子注入劑量與供試菌株致死率的關(guān)系，結(jié)果如圖1所示。

圖1 N+注入輻照獸疫鏈球菌NN-7的存活率曲線Fig.1 Relationship between survival rate and N+implantation dose

從圖1可以看出，隨著N+注入劑量的增加，獸疫鏈球菌NN-7的存活率曲線呈先減小后增大再減小的“馬鞍型”劑量-效應(yīng)曲線，這是離子注入誘變所特有的誘變效應(yīng)的重要表現(xiàn)，與一般電離輻射造成的“指數(shù)型”劑量-效應(yīng)曲線不同。這是因?yàn)榈蛣┝侩x子只對(duì)細(xì)胞表面進(jìn)行損傷和刻蝕，隨著注入劑量的增加，能量沉積所產(chǎn)生的大量自由基致使DNA和生物膜等其他大分子損傷，從而造成存活率急劇下降，但當(dāng)劑量增加至一定閾值時(shí)，注入細(xì)胞的庫侖力形成一個(gè)“保護(hù)屏障”并由此激活細(xì)胞內(nèi)的修復(fù)機(jī)制和修復(fù)酶，使得存活率回升，但隨著劑量繼續(xù)增加，細(xì)胞損傷加劇，從而使得存活率再次下降[10-12]。

不同劑量N+注入輻照對(duì)菌株突變率和正突變率的影響如表1所示。隨著劑量的增加，菌株的突變率和正突變率也隨之增加，當(dāng)注入劑量為8×1014N+/cm2時(shí)，菌株的正突變率最高，超過此劑量后，菌株突變率繼續(xù)增加，但正突變率呈下降趨勢(shì)?，F(xiàn)代育種理論認(rèn)為：被誘變的微生物致死率在75%左右時(shí)產(chǎn)量性狀的正突變率較高，在更高的致死率條件下，突變率雖可能較高，但負(fù)突變率較之正突變率高很多，不利于正突變菌株的篩選[15]。因此根據(jù)圖1和表1結(jié)果，選擇劑量為8×1014N+/cm2作為HA產(chǎn)生菌的離子注入劑量，實(shí)驗(yàn)證明該注入劑量在誘變過程中較為有效。

2.2 離子注入后HA產(chǎn)生菌突變株的篩選

圖2 突變株S-7與原始菌株的菌落形態(tài)對(duì)比Fig.2 Colony morphology of mutant strain (S-7) and original strain (blank)

菌株經(jīng)離子注入后，涂布于血瓊脂平板培養(yǎng)基上，從中篩選出溶血素缺陷型突變菌株25株，并對(duì)其進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)進(jìn)行復(fù)篩，發(fā)酵后測定HA產(chǎn)量及相對(duì)分子質(zhì)量，11株HA產(chǎn)量及相對(duì)分子質(zhì)量較高的菌株的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。經(jīng)離子注入誘變后比較原始菌株和誘變菌株的菌落形態(tài)，突變株S-7于血瓊脂平板培養(yǎng)基培養(yǎng)無明顯的溶血圈出現(xiàn)(圖2)，且發(fā)酵合成的HA產(chǎn)量和相對(duì)分子質(zhì)量均有較大提高，故確定S-7菌株作為下一輪注入誘變的出發(fā)菌株。

以S-7菌株為出發(fā)菌株再次進(jìn)行注入誘變，系列稀釋后涂布于透明質(zhì)酸平板培養(yǎng)基上，從中篩選出透明質(zhì)酸酶缺陷型突變菌株17株，并對(duì)其進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)進(jìn)行復(fù)篩，發(fā)酵后測定HA產(chǎn)量及相對(duì)分子質(zhì)量，部分結(jié)果見表3。

對(duì)照出發(fā)菌株S-7，由表3可知，經(jīng)氮離子注入誘變、透明質(zhì)酸平板培養(yǎng)基篩選及搖瓶發(fā)酵后，有少數(shù)菌發(fā)生了負(fù)突變，不過正突變的菌株占絕大多數(shù)，其中SH-9菌株HA產(chǎn)量最高為3.23g/L，比原始菌株NN-7提高了104.4%，相對(duì)分子質(zhì)量為2.12×106，比原始菌株NN-7提高了35.9%。

2.3 高產(chǎn)菌株SH-9的遺傳穩(wěn)定性

對(duì)SH-9菌株連續(xù)傳代6次，每次均涂布于血瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并分別進(jìn)行搖瓶發(fā)酵后檢測HA產(chǎn)量及相對(duì)分子質(zhì)量，結(jié)果如表4所示。實(shí)驗(yàn)證明6次傳代后突變株都無溶血圈。從傳代結(jié)果可以看出，該高產(chǎn)HA菌株的遺傳性能穩(wěn)定，是一株適合HA生產(chǎn)要求的菌株。

表1 N+注入輻照對(duì)菌株突變率及正突變率的影響Table 1 Effect of N+implantation on mutation rate and positive mutation rate

表2 經(jīng)N+誘變后溶血素酶缺陷型突變株的篩選結(jié)果Table 2 Screening results of hemolysin-degrading enzyme deficient mutant strains induced by N+implantation

表3 經(jīng)N+誘變后透明質(zhì)酸酶缺陷型突變株的篩選結(jié)果Table 3 Screening results of hyaluronic acid-degrading enzyme deficient mutant strains induced by N+implantation

表4 SH-9菌株傳代后HA產(chǎn)量及相對(duì)分子質(zhì)量的變化Table 4 The yield and relative molecular weight of hyaluronic acid produced by cultured SH-9 strain

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用低能氮離子注入的方法用于HA合成菌株的誘變選育，結(jié)果表明，不同注入劑量與菌株的死亡率存在一定的關(guān)系，隨著注入劑量的增加，菌株致死率也隨之增大，在劑量為8×1014N+/cm2時(shí)菌株致死率達(dá)到76%，且在血瓊脂平板培養(yǎng)基和透明質(zhì)酸平板培養(yǎng)基上的正突變率也較高；在經(jīng)N+離子注入誘變后，篩選獲得一株溶血素和透明質(zhì)酸酶雙缺陷型突變株SH-9；經(jīng)搖瓶發(fā)酵，突變株SH-9合成的HA產(chǎn)量達(dá)3.23g/L，比原始菌株的合成水平提高了104.4%，HA相對(duì)分子質(zhì)量為2.12×106，比原始菌株提高了35.9%，因而低能氮離子注入的方法可作為有效手段用于HA高產(chǎn)菌株的誘變選育。

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Screening of High-yield Hyaluronic Acid-producing Strain by Low Energy Ion Implantation

ZHANG Wei1,2，YAO Jun1,*，CHEN Kuan-ting1，SUN Rong-bin3，WEI Qin-jun1，CAO Xin1
(1. Department of Biotechnology, School of Basic Medical Science, Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China；2. Department of Tourism Management, Changshu Central School of Vocational Education, Changshu 215500, China；3. School of Pharmacy, Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China)

Streptococcus zooepidemicus NN-7 was subjected to mutagenesis by means of low energy ion implantation of 8× 1014N+/cm2dose at 30 keV. After culture in selective medium, the mutant strains with double deficiency of hemolysin and hyaluronic acid-degrading enzyme were screened. Among these strains, a mutant strain capable of producing a high yield of hyaluronic acid was selected and designated as SH-9. The strain still revealed excellent passage stability after six generations. The yield of hyaluronic acid reached up to 3.23 g/L with determined relative molecular weight (Mr) of 2.12×106. Compared with the original parent strain, the yield and molecular weight of hyaluronic acid derived from SH-9 were increased by 104.4%and 35.9%, respectively.

hyaluronic acid；Streptococcus zooepidemicus；ion implantation；mutation screening

Q933

A

1002-6630(2011)07-0269-04

2010-08-24

江蘇省高校自然科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目(09KJB530007)

張偉(1975—)，男，助教，學(xué)士，研究方向?yàn)樯锔叻肿?。E-mail：jscswx2000@yahoo.com.cn

*通信作者：姚俊(1979—)，男，講師，博士，研究方向?yàn)樯镝t(yī)用材料。E-mail：joelyao@163.com