文連奎，王立芳，王貴珍

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118)

陸生伊薩酵母降解L-蘋果酸和檸檬酸的研究

文連奎，王立芳，王貴珍

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118)

利用陸生伊薩酵母對L-蘋果酸和檸檬酸進(jìn)行降解，考察菌株的耐受性，陸生伊薩酵母可耐受SO2的最大質(zhì)量濃度為450mg/L、體積分?jǐn)?shù)5%的酒精、最低pH值為2的酸度。對培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，最佳氮源胰蛋白胨質(zhì)量濃度為0.5g/100mL時(shí)，降酸率最高，達(dá)90%以上。對降酸條件進(jìn)行優(yōu)化，接種量在1.25×106～7.5×106CFU/mL范圍內(nèi)，培養(yǎng)時(shí)間為60h時(shí)，菌株對質(zhì)量濃度為8～20g/L的L-蘋果酸和質(zhì)量濃度為8～12g/L檸檬酸降解率均達(dá)90%以上。

陸生伊薩酵母；降解；L-蘋果酸；檸檬酸

L-蘋果酸又名L-2-羥基丁二酸，主要存在于蘋果、葡萄和不成熟的山楂等果實(shí)中[1]；檸檬酸又名枸櫞酸，主要存在于檸檬、柑橘、菠蘿、山楂等果實(shí)中[2]。利用這些含酸量高的果實(shí)生產(chǎn)的果汁和果酒會(huì)有酸澀感，影響產(chǎn)品品質(zhì)。此外，L-蘋果酸和檸檬酸生產(chǎn)企業(yè)排放的廢棄物酸度太高，對環(huán)境造成了嚴(yán)重污染，必須進(jìn)行降酸才能達(dá)到國家規(guī)定的排放標(biāo)準(zhǔn)。采用稀釋法降酸，會(huì)降低果汁和果酒的營養(yǎng)價(jià)值，采用陰離子交換樹脂[3-4]、碳酸鈣沉淀[5]、堿中和[6]、電滲析[7-8]等物理和化學(xué)方法降酸，會(huì)使飲料或果酒口感差，因此現(xiàn)代降酸研究和發(fā)展的方向是微生物降酸法。目前關(guān)于降酸微生物的報(bào)道大多是針對蘋果酸，如葡萄酒生產(chǎn)中利用酒明串珠菌(Leuconostoc oenos)在無氧條件下利用蘋果酸產(chǎn)生乳酸和CO2，但幾乎不利用檸檬酸[9-11]，因此在以檸檬酸為主的果汁中不能發(fā)揮作用；腸膜明串珠菌乳脂亞種(Leu.mesenteroides subsp.cremoris)在無氧條件下能分解檸檬酸，生成乙酸，CO2和雙乙酰[12-13]，若檸檬酸含量較高，產(chǎn)生的雙乙酰足以產(chǎn)生不良的風(fēng)味。而同時(shí)針對蘋果酸和檸檬酸的研究卻很少。

陸生伊薩酵母(Issatchenkia terricola)為酵母科伊薩酵母屬陸生伊薩種[14]。關(guān)于陸生伊薩酵母的報(bào)道很少，惠豐立等[15]篩選得到一株具有抗菌活性的陸生伊薩酵母，而利用該菌株進(jìn)行降酸的研究還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以前期篩選到的陸生伊薩酵母為出發(fā)菌株對其耐受性及降酸條件進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 酵母、培養(yǎng)基與試劑

酵母由本實(shí)驗(yàn)室于葡萄園土壤中篩選獲得，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定其為陸生伊薩酵母(Issatchenkia terricola)[16]。

WL營養(yǎng)培養(yǎng)基：酵母浸粉 0.4g、胰蛋白胨 0.5g、KH2PO40.055g、KCl 0.0425g、無水CaCl20.0125g、FeCl30.00025g、MgSO40.0125g、MnSO40.0002g，蒸餾水100mL，L-蘋果酸或檸檬酸按需加入；保藏培養(yǎng)基：YPD培養(yǎng)基。

L-蘋果酸(分析純)、檸檬酸(分析純) 美國Bio Basic公司；其他試劑如酵母浸粉、KH2PO4、FeCl3等均為化學(xué)純。

1.2 方法

1.2.1 耐受性實(shí)驗(yàn)

將處于對數(shù)生長期的菌懸液，以相同接種量分別接種于含不同質(zhì)量濃度SO2、酒精體積分?jǐn)?shù)和pH值的WL營養(yǎng)培養(yǎng)基中，30℃、150r/min振蕩培養(yǎng)24h，取菌液測定OD600nm(以未接菌的WL營養(yǎng)培養(yǎng)基作空白對照)，確定菌株對SO2、酒精和酸度的耐受性。

1.2.2 降酸培養(yǎng)基成分優(yōu)化

以WL營養(yǎng)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以質(zhì)量濃度為10g/L L-蘋果酸和檸檬酸作為唯一碳源，然后以0.5g/100mL水平分別添加胰蛋白胨、牛肉膏、尿素、(NH4)2SO4、NaNO3，將菌株以相同接種量接入培養(yǎng)基，以150r/min、30℃搖床培養(yǎng)48h后測定菌株對L-蘋果酸和檸檬酸的降解率，確定菌株所利用的最佳氮源；最后調(diào)節(jié)最佳氮源的質(zhì)量濃度分別為0.3、0.5、0.7、0.9、1.1g/100mL，以同樣條件培養(yǎng)，確定最佳氮源的加入量。

1.2.3 降酸條件優(yōu)化

1.2.3.1 酸質(zhì)量濃度對降酸的影響

以WL營養(yǎng)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)L-蘋果酸和檸檬酸的質(zhì)量濃度分別為4、6、8、10、12、14、16、18、20g/L，將菌株以5×106CFU/mL分別接入100mL液體培養(yǎng)基中，30℃、150r/min搖床培養(yǎng)48h后測定降酸率，確定酸質(zhì)量濃度對降酸的影響。

1.2.3.2 接種量對降酸的影響

L-蘋果酸和檸檬酸添加量為10g/L，接種量分別為：1.25×106、2.5×106、3.75×106、5×106、6.25×106、7.5×106CFU/mL，30℃、150r/min搖床培養(yǎng)，每隔10h測定不同接種量對L-蘋果酸和檸檬酸的降解率，確定最佳接種量。

1.2.3.3 菌株的最佳降酸時(shí)間

L-蘋果酸和檸檬酸添加量為10g/L，以1.2.3.2節(jié)的最佳接種量接入100mL液體培養(yǎng)基中，30℃、150r/min搖床培養(yǎng)，每隔10h測定降酸率，確定菌株對L-蘋果酸和檸檬酸的最佳降解時(shí)間。

1.3 指標(biāo)測定方法

菌體的生物量測定采用分光光度法，以最大吸收波長600nm處菌液的光密度表示菌體的數(shù)量，以O(shè)D600nm表示[17]。

酸度測定采用NaOH滴定法[18](以蘋果酸或檸檬酸計(jì)，單位g/L)。

式中：ρ0為降解前蘋果酸(檸檬酸)的質(zhì)量濃度；ρ1為降解后蘋果酸(檸檬酸)的質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐受性實(shí)驗(yàn)

2.1.1 菌株對SO2的耐受性

圖1 SO2質(zhì)量濃度對菌株生長的影響Fig.1 Effect of SO2concentration on the growth of Issatchenkia terricola

由圖1可知，在SO2質(zhì)量濃度≤450mg/L時(shí)，菌體的生長基本不被抑制；SO2質(zhì)量濃度＞450mg/L時(shí)，菌體數(shù)量急劇下降，因此菌株能耐受SO2的最高質(zhì)量濃度為450mg/L。由于SO2的通入量一般在60～100mg/L范圍內(nèi)，就可以抑制其他菌的生長[19]，因此該菌株有足夠的耐受SO2的能力。

2.1.2 菌株對酒精的耐受性

圖2 酒精體積分?jǐn)?shù)對菌株生長的影響Fig.2 Effect of alcohol concentration on the growth of Issatchenkia terricola

由圖2可知，在酒精體積分?jǐn)?shù)≤5%時(shí)，菌體的生長基本不被抑制；酒精體積分?jǐn)?shù)＞5%時(shí)，菌體數(shù)量急劇下降，因此菌株能耐受的最高酒精體積分?jǐn)?shù)為5%。菌株不能耐受較高的酒精度，因此在發(fā)酵降酸時(shí)，可以考慮在酒精發(fā)酵前接入該菌株進(jìn)行降酸。如果為了防止該菌株降酸過度，也可以利用體積分?jǐn)?shù)大于5%的酒精來抑制菌株的生長，從而抑制酸度的進(jìn)一步降低。

2.1.3 菌株對酸度的耐受性

圖3 培養(yǎng)液pH值對菌株生長的影響Fig.3 Effect of medium pH on the growth of Issatchenkia terricola

pH值能夠改變營養(yǎng)物質(zhì)的電離程度，從而影響細(xì)胞對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，最終影響菌體的生長。由圖3可知，在pH 2～5.5范圍內(nèi)酸度對菌株的生長抑制較弱，而在pH＜2和pH＞5.5時(shí)菌體數(shù)量均開始減少，因此菌株能耐受的最低pH值為2，可適用于高酸度果酒、果汁中。

2.2 降酸培養(yǎng)基成分的優(yōu)化

圖4 不同氮源對菌株降酸的影響Fig.4 Effect of different nitrogen sources on deacidification rates of L-malic acid and citric acid

圖5 不同質(zhì)量濃度的胰蛋白胨對菌株降酸的影響Fig.5 Effect of tryptone concentration on deacidification rates of L-malic acid and citric acid

由圖4～5可知，與無機(jī)氮源相比，有機(jī)氮源更有利于酸度的降低，添加0.5g/100mL胰蛋白胨時(shí)，菌株的降酸率最高，可達(dá)90%以上。

2.3 降酸工藝條件優(yōu)化

2.3.1 酸質(zhì)量濃度對降酸的影響

圖6 L-蘋果酸和檸檬酸質(zhì)量濃度對降酸的影響Fig.6 Effects of L-malic acid and critic acid concentrations on their deacidification rates

由圖6可知，在質(zhì)量濃度4～12g/L范圍內(nèi)菌株對L-蘋果酸和檸檬酸的降解能力相差不大；當(dāng)超過12g/L時(shí)，菌株對L-蘋果酸的降解能力變化不大，但對檸檬酸的降解能力卻明顯減弱，這說明檸檬酸質(zhì)量濃度大于12g/L時(shí)，已不利于菌株代謝產(chǎn)生的降酸酶發(fā)揮作用，L-蘋果酸則對其影響不大。隨著酸質(zhì)量濃度的增大，降酸率呈現(xiàn)先增后減的趨勢，主要是由于pH值的變化，影響了菌體的生長，從而影響了菌株的降酸速率。傳代培養(yǎng)10代后，測得其降酸性能仍較穩(wěn)定。

2.3.2 接種量對降酸的影響

圖7 接種量對菌株降解L-蘋果酸的影響Fig.7 Effect of inoculum size on deacidification rate of L-malic acid

圖8 接種量對菌株降解檸檬酸的影響Fig.8 Effect of inoculum size on deacidification rate of citric acid

由圖7可知，隨著接種量的增加，菌株生長延緩期縮短，接種量大的對L-蘋果酸的降解率較高，但是隨著時(shí)間的延長，由接種量產(chǎn)生的降解率差異越來越小，當(dāng)培養(yǎng)60h時(shí)，降解率幾乎持平，接種量對檸檬酸的降解情況也是如此(圖8)。由此說明，接種量對降酸率的影響不大，但要縮短延緩期，接種量應(yīng)大于106CFU/mL。

2.3.3 菌株降酸的最佳時(shí)間

圖9 菌株降酸的最佳時(shí)間Fig.9 Time course of degradation of L-malic acid and citric acid during fermentation

由圖9可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，菌株對L-蘋果酸和檸檬酸的降解率都逐漸增大，但菌株對L-蘋果酸的降解率明顯高于檸檬酸，說明與檸檬酸相比，菌株更容易利用L-蘋果酸。當(dāng)發(fā)酵60h時(shí)菌株對兩者的降酸率達(dá)到最高，均為93%。因此，菌株降酸的最佳時(shí)間為60h。

3 結(jié) 論

陸生伊薩酵母能耐受SO2的最大質(zhì)量濃度為450mg/L，酒精體積分?jǐn)?shù)為5%，最低pH值為2。對降酸培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，胰蛋白胨質(zhì)量濃度為0.5g/mL時(shí)，菌株對L-蘋果酸和檸檬酸的降解率最高，均達(dá)90%以上。

對降酸條件進(jìn)行優(yōu)化，在30℃、150r/min條件下培養(yǎng)，L-蘋果酸質(zhì)量濃度為8～20g/L或檸檬酸質(zhì)量濃度為8～12g/L時(shí)，菌株的降酸率最高，均達(dá)90%以上；對1.25×106～7.5×106CFU/mL范圍的接種量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明此范圍的接種量對降酸率影響不大；當(dāng)培養(yǎng)60h時(shí)菌株對兩種酸的降解率達(dá)到最高，均為93%，因此最佳降酸時(shí)間為60h。

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Degradation of L-Malic and Critic Acids by Issatchenkia terricola

WEN Lian-kui，WANG Li-fang，WANG Gui-zhen
(College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

The degradation potential of Issatchenkia terricola fermentation to L-malic acid and citric acid was explored. The maximum concentrations of SO2and alcohol and the minimum pH level that the strain could tolerate were 450 mg/L, 5% and 2, respectively. The medium and fermentation conditions for the degradation of both acids by the strain were optimized based on deacidification rate. When the concentration of the determined optimum nitrogen source tryptone was 0.5 g/100 mL, the deacidification rate reached its maximum level, over 90%. The optimum inoculum size and incubation duration were 1.25 × 106-7.5 × 106CFU/mL and 60 h, respectively, and the resulting degradation rates of 8-20 g/L L-malic acid and 8-12 g/L critic acid reached over 90%.

Issatchenkia terricola；degradation；L-malic acid；critic acid

TS261.1

A

1002-6630(2011)07-0220-04

2010-08-28

吉林省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目(20090228)

文連奎(1962—)，男，教授，博士，主要從事長白山野生植物資源的開發(fā)利用研究。E-mail：wenliankui@163.com