胡嘯玲 湯恢煥 周志剛 尹 峰 劉文捷 (中南大學湘雅醫(yī)院,湖南 衡陽 4200)

大腸癌是世界常見的惡性腫瘤之一,對化療敏感性低、多藥耐藥致晚期腫瘤死亡率高,故尋找高效、毒副作用小的大腸癌耐藥逆轉方法具有重要社會效益和廣闊臨床應用前景。研究報道過氧化物酶體增殖因子活化受體 γ(PPARγ)配體羅格列酮(ROZ)抗腫瘤機制有:①誘導細胞凋亡〔1〕;②改變細胞周期〔2〕;③誘導腫瘤細胞分化〔3〕;④抑制環(huán)氧合酶 2(COX-2)表達〔4〕;⑤誘導腫瘤抑制基因酪氨酸磷酸酶蛋白(PTEN)表達上調〔5〕;⑥調節(jié)醛脫氫酶 3(ALDH3)表達〔6〕;⑦調節(jié)抗腫瘤免疫〔7〕;⑧抑制腫瘤細胞轉移相關蛋白的表達;⑨抑制腫瘤新生血管形成等〔8〕。本文通過觀察 ROZ和 5-氟尿嘧啶(5-Fu)對人結腸癌細胞系 HT-29細胞的體外誘導凋亡作用以及在無細胞毒作用濃度下 ROZ和 5-Fu聯(lián)合用藥時的化療增敏作用,初步探討其誘導體外培養(yǎng) HT-29細胞凋亡及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 HT-29細胞系購自中國典型培養(yǎng)物中心。核轉錄因子(NF)-κB、PPARγ、Bcl-2、Bax購自邁新生物技術有限公司;聚丙烯酰胺凝膠電泳所用各種分子生物學試劑均購自Amreco公司;流式細胞儀,Beckerman coulter EPICS-XL;圖像分析系統(tǒng)(PIPS-2020),重慶天海醫(yī)療設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 AO/EB熒光染色顯微鏡觀察細胞凋亡 取對數(shù)生長期細胞,消化,制成單細胞懸液,接種于 50 ml培養(yǎng)瓶中,每瓶4.5ml細胞懸液,含 HT-29細胞 4×107個。細胞置 37℃、95%濕度、含 5%CO2培養(yǎng)箱孵育 12 h后取出,ROZ組加入 0.5 ml不同濃度的 ROZ溶液,使各組 ROZ終濃度分別為 1.0、10.0、100.0μmol/L;ROZ與 5-Fu聯(lián)合組加入 0.25 ml ROZ(終濃度為 1.0μmol/L)溶液和 0.25 ml不同濃度的 5-Fu溶液,使 5-Fu溶液終濃度分別為 3.0、6.0、12.0μg/L;環(huán)胞素A(CsA)與 5-Fu聯(lián)合組加入 0.25 ml CsA(終濃度為 50 ng/ml)溶液和 0.25 ml的 5-Fu溶液(終濃度 6.0μg/L);5-Fu組加入 0.5 ml不同濃度的 5-Fu溶液,終濃度分別為 3.0、6.0、12.0μg/L;對照組換等量培養(yǎng)基,培養(yǎng) 24h。以胰酶消化,收集約 1×107個細胞,離心棄上清液加磷酸鹽緩沖液(PBS)洗 3次,制成細胞懸液,吸95μl細胞懸液加入 5μl吖啶橙(AO)染液,充分混勻,滴于玻片上,分別計數(shù)。細胞凋亡率(%)=〔(早期凋亡細胞+晚期凋亡細胞)/全部細胞〕×100%。

1.2.2 流式細胞術分析細胞周期和細胞凋亡率 取對數(shù)生長期細胞,棄去舊培養(yǎng)基,以胰酶消化,制成單細胞懸液,接種于50 ml培養(yǎng)瓶中,每瓶 4.5 ml細胞懸液,含 HT-29細胞 4×107個。細胞置 37℃,95%濕度,含 5%CO2培養(yǎng)箱孵育 12 h后取出。進行分組處理,其分組、各組液體的濃度與 1.2.1相同,對照組換等量培養(yǎng)基,培養(yǎng) 24 h后,收集 1×106以上細胞,PBS洗 2遍,棄上清液,用 75%乙醇固定,過夜,PBS洗 3次后,經0.5g/L的 RnaseA消化 30 min,終濃度 65 mg/L的碘化丙啶(PI)染色 1 h后流式細胞儀(型號為 FACS420)測定,分析細胞周期,計算凋亡率。

1.2.3 Western印跡分析 觀察 ROZ處理 HT-29后 PPARγ、NF-κB、Bcl-2、Bax蛋白表達情況。細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期時,加 ROZ及 PPARγ特異阻斷劑白楊素(陽性對照藥)處理。作量效關系研究時用 Roz(終濃度為 1.0,10.0,100.0μmol/L)分別處理對數(shù)生長期 HT-29細胞,培養(yǎng) 12 h后收集細胞;作時效關系研究時用 10.0μmol/L的ROZ分別處理對數(shù)生長期 HT-29細胞,0、4、8、12 h后收集細胞。以冷 PBS洗 2次,濾紙吸干,加入適量的裂解液置于冰上孵育 30 min,細胞刮收集細胞于EP管,4℃離心,12 000 r/min×10 min,上清液即為細胞總蛋白,用二喹啉甲酸(BCA)試劑進行蛋白定量。調節(jié)每份樣品濃度,以每孔 20μg的蛋白量上樣,樣品加入等體積的 2×十二烷基硫酸鈉(SDS)加樣緩沖液,沸水煮沸 10 min,根據不同蛋白分子量用不同濃度的 SDS-聚丙烯凝膠(PAGE)電泳后轉膜,加入相應的Ⅰ抗、Ⅱ抗孵育,用辣根過氧化物酶-電化學熒光法(HRP-ECL)顯影壓片。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行分析,one-way ANOVA和 t檢驗法分析,數(shù)值用±s表示。

2 結 果

2.1 流式細胞儀分析ROZ、5-Fu對 HT-29細胞凋亡和細胞周期的影響

2.1.1 ROZ對細胞凋亡的影響 流式細胞術顯示HT-29細胞的自然凋亡率為(1.82±0.26)%,1.0μmol/L的 ROZ并不誘導細胞凋亡。見表 1。

表1 流式細胞儀檢測ROZ對 5-Fu誘導HT-29細胞凋亡的影響(±s,n=3,%)

表1 流式細胞儀檢測ROZ對 5-Fu誘導HT-29細胞凋亡的影響(±s,n=3,%)

與 5-Fu組比較:1)P＜0.01

組別 凋亡率(%)5-Fu 5-Fu+1.0μmol/L ROZ 5-Fu 0μg/ml組 1.82±0.26 1.60±0.21 5-Fu 3.0μg/ml組 20.7±0.46 28.1±0.701)5-Fu 6.0μg/ml組 23.67±0.43 32.67±0.451)5-Fu 12.0μg/ml組 30.34±0.97 40.26±0.731)

2.1.2 ROZ促進5-Fu誘導 HT-29細胞凋亡 不同濃度的 5-Fu(3.0,6.0,12.0μg/ml)與細胞作用 72 h后,一定程度上誘導HT-29細胞凋亡,但與 ROZ(1.0μmol/L)合用時,其凋亡率均有增加。見表 1,圖 1。

2.1.3 ROZ聯(lián)合不同濃度 5-Fu對HF-29細胞凋亡周期的影響 見表 2。

2.2 AO/EB熒光染色法檢測ROZ對HT-29細胞凋亡的影響HT-29細胞的自然凋亡率為(1.43±0.25)%。1.0、10.0、100.0μmol/L的 ROZ作用 72 h后凋亡率分別為(1.44±0.07)%,(2.34±0.23)%,(14.13±1.36)%。此結果與流式細胞術所檢測結果一致。

2.3 AO/EB熒光染色法檢測 ROZ與 5-Fu合用時對 HT-29細胞凋亡的影響 當1.0μmol/L ROZ作用 72 h后,HT-29細胞的凋亡率為(1.44±0.07)%,與二甲基亞砜(DMSO)對照組細胞凋亡率〔(1.15±0.13)%〕無明顯差異,提示 1.0μmol/L ROZ無誘導HT-29細胞凋亡作用。5-Fu(3.0、6.0、12.0μg/ml)組的凋亡細胞率分別為(13.91±0.38)%,(18.16±0.42)%,(23.14±2.69)%,當 1.0μmol/L ROZ聯(lián)合不同濃度的 5-Fu(3.0、6.0、12.0μg/ml)處理 HT-29細胞,其凋亡率分別為(27.35±0.86)%,(33.89±1.16)%,(38±1.62)%。凋亡細胞較單用 5-Fu明顯增加(P＜0.01)。CsA(5 ng/ml)組、5-Fu(6.0μg/ml)+CsA(5 ng/ml)+ROZ(1.0μmol/L)組凋亡率分別為(1.21±0.20)%、(38.62±1.05)%。

熒光顯微鏡下觀察細胞,正常形態(tài)飽滿,細胞質呈綠色,核染色為亮綠色,核形態(tài)較為規(guī)則,均為圓形或橢圓形;5-Fu(6.0μg/ml)、ROZ(1.0μmol/L)和 5-Fu(6.0μg/ml)聯(lián)合 ROZ(1.0μmol/L)分別處理 72h的 HT-29細胞可見部分細胞體積明顯變小,細胞外形皺折,結構模糊,呈致密濃染的桔黃色或紅色熒光,可見細胞胞漿減少、細胞核染色質固縮偏向一邊,核碎裂和核裂解為質膜包繞的碎片,細胞膜完整,表面有牙狀突起等凋亡細胞形態(tài)學改變,并可見細胞碎片。凋亡率以 5-Fu聯(lián)合 ROZ組最高,呈劑量依賴性。見圖 1。

2.4 Western印跡法測定 ROZ對 HT-29細胞 PPARγ、NF-κB、Bcl-2、Bax表達的影響 3.0μmol/L的 ROZ處理 HT-29細胞4 h后 PPARγ表達上調,NF-κB表達下調、Bcl-2表達下調、Bax表達上調,呈時間依賴性。見圖 2。1.0,10.0,100.0μmol/L ROZ和白楊素 100.0μmol/L分別處理 HT-29細胞 12 h,PPARγ和 Bax蛋白表達上調,NF-κB和 Bcl-2蛋白表達下調、Bcl-2/Bax比例下降,呈濃度依賴性。與空白對照組比較,有顯著性差異(P＜0.05)。而使用 PPARγ特異阻斷劑白楊素后,上述作用即可逆轉。見圖 3、圖 4,表 3～表 5。

圖1 AO/EB熒光染色熒光顯微鏡觀察 ROZ與5-Fu合用誘導 HT-29細胞凋亡作用(×400)

表2 羅格列酮聯(lián)合不同濃度 5-Fu(μmol/L)對 HT-29細胞凋亡周期的影響

表3 羅格列酮(3.0μmol/L)對 HT-29細胞不同時間各組蛋白表達的影響

表4 不同濃度羅格列酮對HT-29細胞各組蛋白表達的影響

表5 PPARγ阻斷劑白揚素與不同濃度 ROZ相互作用后對 HT-29細胞 Bcl-2/PPARγ蛋白表達的影響

圖2 HT-29細胞不同時間 Bax、Bcl-2、NF-κB、PPARγ蛋白表達的影響

圖3 不同濃度 ROZ對 HT-29細胞 PPARγ、Bax、NF-κB、Bcl-2蛋白表達的影響

圖4 PPARγ阻斷劑與不同濃度ROZ相互作用后對 HT-29細胞 Bcl-2、PPARγ蛋白表達的影響

3 討 論

3.1 ROZ對HT-29細胞的作用及可能機制 PPAR是 1990年發(fā)現(xiàn)的一類與甲狀腺激素和維甲酸受體密切相關的核激素受體,可分為 PPARα、PPARβ、PPARγ三個亞族〔9〕。其中生物學功能最復雜和研究最多的是 PPARγ。近年來大量研究〔10,11〕發(fā)現(xiàn) PPARγ在多種腫瘤組織及其癌旁組織中均有表達,如肺、乳腺、前列腺及消化道腫瘤及其癌旁組織中,PPARγ配體能促進腫瘤細胞凋亡,從而起到對腫瘤的化學預防和治療作用。因此,本文用 PPARγ合成配體 ROZ作用于體外培養(yǎng)的 HT-29細胞,觀察其對HT-29細胞的凋亡影響,并通過對相關的分子生物學指標的檢測,初步探討其作用機制。

本實驗通過 FCM分析、AO熒光染色法及 Western印跡證實 PPARγ的配體 ROZ對 HT-29細胞有促進凋亡作用。FCM周期分析顯示,ROZ能誘導HT-29細胞調亡,呈劑量依賴性,它使 HT-29細胞阻滯于G1期。同時通過 Western印跡法對與細胞周期和凋亡相關的一些基因的表達進行了檢測,結果顯示,ROZ作用后,HT-29細胞的 PPARγ蛋白核內表達上調、NF-κB蛋白、Bcl-2蛋白表達下調、Bax蛋白表達上調。這提示 ROZ對HT-29細胞所產生的抑制作用可能是通過二條通路實現(xiàn)的:一是影響細胞周期的進程,二是誘導細胞凋亡。

NF-κB能調控許多基因表達,在腫瘤的形成和轉移過程中發(fā)揮重要作用。生理狀態(tài)下 NF-κB位于胞質內,呈非活性狀態(tài)與 NF-κB抑制蛋白(IκB)結合,一旦被病毒、氧化劑、炎癥細胞因子等刺激劑激活后便與IκB解離而轉入核內與特異的啟動子結合,從而調控基因的表達〔12〕。研究發(fā)現(xiàn)〔13,14〕,NF-κB過度激活與許多病毒和非病毒的惡性腫瘤有關,如肝癌、大腸癌,肺癌等,NF-κB導致癌癥的發(fā)生是因為細胞因子或其受體基因轉錄的激活,阻斷了凋亡。其次 NF-κB活化可直接作用于 DNA復制或具有促進細胞周期素D1(Cyclin D1)表達及 G1/S轉換功能,使細胞過度增殖導致癌癥的發(fā)生〔15〕。體外實驗表明抑制 NF-κB能促進腫瘤細胞發(fā)生凋亡〔16〕。本實驗證明 NF-κB因子在HT-29細胞上呈激活狀態(tài),HT-29細胞經ROZ處理后與對照組比較,NF-κB蛋白核內表達明顯下調,而 HT-29細胞出現(xiàn)增殖抑制,凋亡率增加。

本研究證實PPARγ蛋白在 HT-29細胞的胞漿及核膜上表達,ROZ作用后,PPARγ蛋白在核內表達明顯上調,與 Chen等〔17〕人結果相一致。HT-29細胞經 ROZ處理后與對照組比較,NF-κB蛋白核內表達明顯下調。這提示 PPARγ的合成配體 ROZ抑制 HT-29細胞增殖促進 HT-29細胞發(fā)生凋亡,與激活 PPARγ受體進而抑制 NF-κB有關。

Bcl-2基因是一種抗凋亡基因,其編碼的蛋白Bcl-2是一種結合于核膜、線粒體膜和內質網膜外表面的蛋白質,Bcl-2通過改變膜對一些離子、小分子或蛋白質的通透性而參與細胞凋亡的調控。Bcl-2可通過多種途徑起到抗細胞凋亡作用而Bax促進細胞凋亡,細胞內Bcl-2的數(shù)量過多會使正常細胞轉化為腫瘤細胞,即使接受凋亡信號也不會發(fā)生凋亡〔18〕。本研究證實,HT-29細胞經 ROZ處理后,與對照組比較 Bcl-2蛋白表達明顯下降,而 Bax蛋白表達增高,Bcl-2/Bax比值降低,HT-29細胞增殖抑制,細胞凋亡率增加。

有研究證實〔19,20〕,NF-κB通過誘導或上調抗凋亡基因Bcl-2抑制凋亡。本研究通過 Western印跡法對與細胞周期和凋亡相關的一些基因的表達進行檢測,發(fā)現(xiàn) ROZ作用后,HT-29細胞的 NF-κB蛋白核內表達下調、Bcl-2蛋白表達下調、Bax蛋白表達上調,Bcl-2/Bax比值降低從而抑制HT-29細胞增殖,促進 HT-29細胞凋亡。這提示 HT-29細胞經 ROZ作用后,PPARγ受體活化、下調 NF-κB蛋白、Bcl-2蛋白表達,下調 Bcl-2/Bax比值,發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖,誘導細胞凋亡的作用。而使用 PPARγ特異阻斷劑后,上述作用即可消失,PPARγ受體不能活化,而BCL-2蛋白表達上調。

3.2 ROZ增加HT-29細胞對 5-Fu的敏感性及可能機制 對化療耐藥性的研究表明,NF-κB、Bcl-2與化療耐藥相關。Bcl-2/Bax比值可作為預測腫瘤患者是否存在耐藥的一項指標。另外有研究表明,NF-κB通過誘導或上調抗凋亡基因,能激活 B細胞淋巴瘤/Bcl-2家族中抗凋亡蛋白(AL/Bfl-1)而抑制由腫瘤壞死因子-α(TNF-α)引起的細胞凋亡〔19〕。 Chen等〔17〕人研究證實:15d-PGJ2,環(huán)格列酮可顯著抑制 NF-κB表達進而下調 bcl-2的表達,從而抑制HT-29細胞生長和誘導細胞凋亡。本研究已證實ROZ可通過與PPARγ受體來影響一些和腫瘤耐藥有關的基因表達。Cox等〔21〕報道臨床常規(guī)劑量口服給藥后,ROZ的人體血藥峰值濃度為 1.67μmol/L。AO染色熒光顯微鏡法和FCM法結果皆顯示:ROZ、5-Fu能誘導 HT-29細胞凋亡,呈劑量依賴性。1.0μmol/L ROZ能明顯增強5-Fu對HT-29細胞凋亡誘導作用。ROZ使 HT-29細胞阻滯于 G1期,呈劑量依賴性。West印跡法顯示,ROZ作用 24 h后 HT-29細胞的 PPARγ蛋白表達明顯上調,NF-κB,Bcl-2蛋白表達上調,Bcl-2相關 X蛋白(BAX)蛋白表達上調,增強 5-Fu對HT-29細胞的增殖抑制或誘導凋亡作用。而 PPARγ的特異阻斷劑白楊素可以逆轉上述作用。因此認為 ROZ可通過激活 PPARγ受體,進而抑制NF-κB、Bcl-2蛋白表達,下調 Bcl-2/Bax比值,增敏 5-Fu對 HT-29細胞的增殖抑制和誘導凋亡作用。

綜上所述,ROZ誘導HT-29細胞增殖和凋亡機制之一可能與抑制腫瘤細胞NF-κB進而抑制Bcl-2蛋白表達,上調Bax蛋白表達有關。而 ROZ增強HT-29細胞對 5-Fu敏感性機制之一可能同樣與這三種凋亡相關蛋白相互作用,使大腸癌細胞重新啟動凋亡機制有關。

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