張明明 帖彥青 馬 倩 宋光耀 孫海娟 郝志華 王俊明

(河北省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,河北 石家莊 050051)

膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(cholesteryl ester transfer protein,CETP)是協(xié)調(diào)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的重要蛋白,與血脂水平及血漿中高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的水平、成分組成及顆粒的大小均密切相關(guān)〔1〕,在膽固醇的代謝中具有非常重要的作用。某些基因多態(tài)性可以改變CETP的活性及功能,對(duì)脂代謝產(chǎn)生影響,從而影響動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)的發(fā)生與發(fā)展。迄今發(fā)現(xiàn)的CETP多態(tài)位點(diǎn)至少包括啟動(dòng)子區(qū) 11個(gè)、內(nèi)含子 21個(gè)、外顯子 16個(gè),其中以 D442G和R451Q最為常見(jiàn)。但迄今關(guān)于 CETP基因多態(tài)性與血清膽固醇水平的關(guān)系尚不完全明確,故本研究應(yīng)用PCR-RFLP技術(shù)檢測(cè) CETP基因 D442G突變?cè)诓煌巳旱幕蝾l率和基因型頻率,同時(shí)測(cè)定血清CETP濃度、血脂水平,探討 D442G突變與血漿膽固醇水平的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 730例膽固醇異常患者均來(lái)自我院體檢中心,排除了 LDL-R、ApoB100基因突變。按照 2007年“中國(guó)成人血脂異常防治指南”標(biāo)準(zhǔn)〔2〕,分為:(1)高膽固醇血癥組(HC組)446例,總膽固醇(TC)≥6.22 mmol/L(240 mg/dl)和甘油三酯(TG)＜1.7 mmol/L,其中男 290例,女 156例;年齡 36～58歲,平均(46.81±10.40)歲;(2)邊緣高膽固醇血癥組(BHC組)284例,5.18 mmol/L＜TC＜6.19mmol/L(200mg/dl＜TC＜239mg/dl)和 TG＜1.7 mmol/L,其中男 165例,女 119例,年齡34～59歲,平均(45.56±10.24)歲。同時(shí)收集對(duì)照組(NC組)187例,TC≤5.18 mmol/L(200 mg/dl),且 LDL-C＜3.12 mmol/L,其中男 100例,女 87例,年齡 35～59歲,平均(46.07±10.35)歲。血脂異常均為初次診斷,且未用任何降脂藥物。所有研究對(duì)象常規(guī)檢查均未發(fā)現(xiàn)異常,且所有受試對(duì)象均除外影響脂類(lèi)代謝的疾病,排除應(yīng)用影響糖脂代謝藥物者。

1.2 方法

1.2.1 一般指標(biāo) 測(cè)量身高、體重、腰圍和血壓,計(jì)算體重指數(shù)(BMI)=體重(kg)/身高(m2)。

1.2.2 血脂測(cè)定 體檢人群過(guò)夜空腹 12 h,次日清晨抽取肘靜脈血,留取 4ml,置于促凝管中,分離血清,待測(cè)血脂;另取4 ml置于EDTA抗凝管中,-80℃低溫冰箱中保存,用于提取DNA。 TC、TG、HDL-C采用酶法測(cè)定,由 Beckman全自動(dòng)生化分析儀測(cè)得,LDL-C按 Friedwald公式計(jì)算得出,LDL-C=TC-(HDL-C+TG/2.2)。

1.2.3 ELISA檢測(cè) CETP濃度 CETP試劑盒E0814h由武漢晶美生物有限公司提供,最小可測(cè)人CETP濃度為 0.78 ng/ml;板內(nèi)、板間變異系數(shù)均 ＜10%。依據(jù)試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作,測(cè)定血清中 CETP濃度。

1.2.4 CETP基因的多態(tài)性分析(PCR-RELF) (1)人基因組DNA的提取:EDTA抗凝血 400μl,按照天根 TIANamp Blood DNA Kit血液基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)說(shuō)明書(shū)提取基因組 DNA。(2)PCR擴(kuò)增LDL-R基因目的片段:引物設(shè)計(jì)采用生物學(xué)軟件 Primer5.0,并與 GenBank進(jìn)行比對(duì)。序列為:上游引物 5′-AGCAAAGGCGTGAGCCTCTCCG-3′,下游引物 5′-AGGAGGGAGCCAAGCTGGTAGA-3′。上游引物 P3設(shè)計(jì)時(shí)將其 3′端第 3個(gè)堿基設(shè)計(jì)為 C,而模板為 T,當(dāng) CETP基因第 1506位堿基由A突變?yōu)镚時(shí),就形成了 MspⅠ酶切位點(diǎn),PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度179 bp。 PCR反應(yīng)體系:共 20 μl,包括:KOD plus(5U/μl)0.5μl、上下游引物各 1 μl、基因組 DNA 1 μl、dNTP Mixture 1 μl、buffer 2μl、ddH2O 13.5 μl。 PCR反應(yīng)采用降落聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù),反應(yīng)條件見(jiàn)文獻(xiàn)〔3〕。瓊脂糖電泳鑒定 PCR產(chǎn)物。(3)PCR反應(yīng)產(chǎn)物的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析:PCR產(chǎn)物用限制性?xún)?nèi)切酶 MspⅠ進(jìn)行酶切,反應(yīng)體系共 20μl,包括 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 5μl,限制性?xún)?nèi)切酶 1μl,Buffer 2μl以及雙蒸水。于37℃水浴酶切 4 h,加入 buffer 2μl終止反應(yīng)。酶切產(chǎn)物經(jīng) 8%聚丙烯酰胺凝膠(8%PAGE-Gel)電泳,100 mV,50 min,并與Marker比較,用 UVPGD-8000凝膠圖像分析系統(tǒng)鑒定,照相。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0軟件。計(jì)量資料采用±s表示,多組比較采用單因素方差分析,基因頻率采用基因計(jì)數(shù)法計(jì)算;組間基因型與等位基因頻率比較采用 χ2檢驗(yàn),Logistic回歸分析 CETP基因多態(tài)位點(diǎn)與血清膽固醇水平升高的關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1 三組血脂及CETP濃度的比較 三組年齡、性別均匹配,BMI在正常組、高膽固醇血癥組、邊緣高膽固醇血癥組依次升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均 P＜0.05),HDL在正常組、邊緣高膽固醇血癥組、高膽固醇血癥組依次降低,CETP濃度依次升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05),見(jiàn)表 1。

表1 三組血脂及CETP濃度的比較(±s)

表1 三組血脂及CETP濃度的比較(±s)

與 NC組比較:1)P＜0.05,與 BHC組比較:2)P＜0.05;表 2同

指標(biāo) NC組(n=187)BHC組(n=284)HC組(n=446)年齡(歲) 46.41±10.45 46.38±10.63 47.01±11.05 BMI(kg/m2) 23.76±2.34 25.14±3.021) 25.04±2.481)TC(mmol/L) 4.36±0.51 5.66±0.431) 7.99±0.781)2)TG(mmol/L) 1.02±0.31 1.09±0.31 1.10±0.37 HDL(mmol/L) 1.42±0.29 1.27±0.371) 1.09±0.361)2)LDL(mmol/L) 2.42±0.48 4.21±0.611) 5.47±0.791)2)CETP(mg/L) 1.65±0.78 2.18±1.211) 2.48±1.391)2)

2.2 CETP基因D442G突變基因型的判定

2.2.1 PCR-RFLP分型 根據(jù)限制性?xún)?nèi)切酶 Msp I的酶切情況,表現(xiàn)為DD基因型、DG基因型和 GG基因型。PCR產(chǎn)物為179bp,DD野生型因無(wú)酶切位點(diǎn)仍為 179 bp,DG雜合子為179bp和 159 bp兩個(gè)片段,GG突變純合子有 Msp I酶切位點(diǎn),為 159 bp的 1條帶。見(jiàn)圖 1。

圖1 CETP基因第 15外顯子MspⅠ酶切后的電泳結(jié)果

2.2.2 DNA序列分析 經(jīng)過(guò)酶切分型后,取 PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。D442G突變是CETP基因第 15外顯子 1506位核苷酸發(fā)生A→G錯(cuò)義突變,上游引物 3′端第 3位設(shè)計(jì)引入 T→C錯(cuò)配堿基以形成 Msp I酶切位點(diǎn)(C↓CGG)。若為突變型(A→G)則有Msp I酶切位點(diǎn)。以上均經(jīng)DNA測(cè)序證實(shí)了酶切分析的位點(diǎn)準(zhǔn)確性。見(jiàn)圖 2。

圖2 CETP基因D442G突變的DNA測(cè)序結(jié)果

2.3 CETP基因D442G突變基因型和等位基因頻率分布 在對(duì)照組中未發(fā)現(xiàn) D442G突變的純合子 GG型,而HC組和BHC組中均發(fā)現(xiàn)D442G突變的純合子GG型。三組D442G突變GG基因型及 G等位基因的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),HC組中 GG基因型及 G等位基因頻率明顯高于其余兩組(P＜0.05)。見(jiàn)表 2。

表2 CETP基因 D442G突變基因型和等位基因頻率分布〔n(%)〕

2.4 CETP基因D442G突變不同基因型間血脂與 CETP濃度比較 HC組 GG基因型者與 DG基因型、DD基因型比較,其血清 TC、HDL-C、LDL-C水平有逐漸下降的趨勢(shì),CETP水平有逐漸上升的趨勢(shì),其中 TC、CETP、LDL-C水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),HDL-C水平在三組之間差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。BHC組和對(duì)照組 DG基因型的TC、LDL-C均高于DD基因型,CETP濃度低于DD基因型(P＜0.05),HDL-C水平高于 DD基因型(P＞0.05)。見(jiàn)表 3。

2.5 CETP基因D442G突變與HC的關(guān)系 以TC作為應(yīng)變量(Y),以性別、年齡、BMI、TC、TG、HDL和 CETP基因 D442G基因型為自變量(X)進(jìn)行多因素 Logistic回歸分析,發(fā)現(xiàn) CETP基因 D442G突變 GG基因型(OR=2.60,95%CI 1.418～4.764,B=0.955,SE=0.309,Wald=9.552,P=0.002)是高膽固醇血癥的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

表3 CETP基因 D442G突變不同基因型間血脂和CETP濃度的比較(±s)

表3 CETP基因 D442G突變不同基因型間血脂和CETP濃度的比較(±s)

與 DD基因型比較:1)P＜0.05,與 DG基因型比較:2)P＜0.05;與GG基因型比較:3)P＜0.05

指標(biāo) HC組(n=446)DD DG GG BHC組(n=284)DD DG GG NC組(n=187)DD DG GG TC(mmol/L) 7.31±1.20 11.1±0.931) 12.51±1.871)2) 5.88±0.23 6.17±0.021) - 4.23±0.30 4.77±0.021) -TG(mmol/L) 0.98±0.29 1.00±0.33 0.99±0.38 0.99±0.27 0.93±0.37 - 1.01±0.33 1.02±0.10 -HDL(mmol/L) 1.20±0.30 1.24±0.36 1.31±0.38 1.22±0.39 1.37±0.29 - 1.19±0.07 1.27±0.20 -LDL(mmol/L) 5.60±1.33 9.52±1.261) 10.86±1.911)2) 4.02±0.49 4.28±0.251) - 2.45±0.42 3.31±0.751) -CETP(mg/L)2.61±1.243) 2.46±1.223) 2.29±0.51 2.34±1.18 2.17±1.13 - 1.92±1.16 1.58±1.07 -

3 討 論

高膽固醇血癥可導(dǎo)致多種疾病,故與其相關(guān)的CETP基因研究也日益受到重視。CETP基因長(zhǎng)度為25 kb,位于人類(lèi)16號(hào)染色體長(zhǎng)臂(16q12～21),包含 16個(gè)外顯子和 15個(gè)內(nèi)含子〔4〕,編碼產(chǎn)物 CETP在膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)中起關(guān)鍵作用〔5〕。CETP影響 HDL和 LDL顆粒大小的分布,是參與 HDL代謝和決定HDL、LDL水平的重要因素〔6,7〕。CETP基因的改變將影響其蛋白水平的表達(dá),從而影響脂質(zhì)的代謝,進(jìn)而對(duì)與脂質(zhì)密切相關(guān)的疾病產(chǎn)生影響。

王永志〔8〕等研究發(fā)現(xiàn)在高膽固醇血癥患者中 CETP的濃度和活性有顯著變化,對(duì)脂代謝起到重要的調(diào)節(jié)作用。本研究CETP在高膽固醇血癥組與對(duì)照組有顯著性差異驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)。而且在本研究中 DD、DG、GG三種基因型 CETP的濃度也存在顯著差異,DD型純合子的CETP濃度明顯高于其余兩種基因型,提示CETP基因D442G基因突變影響 CETP的濃度和活性。

CETP基因的 D442G突變是第 15外顯子的錯(cuò)義突變442Asp→Gly(D442G),即 cDNA第 1506位堿基 A→G轉(zhuǎn)換突變,導(dǎo)致第 442位天冬氨酸(Asp)被甘氨酸(Glv)替代。由于突變位點(diǎn)靠近脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)活性中心,影響 CETP的合成及活性,D442G在降低CETP水平的同時(shí),還能升高 HDL-C水平。有資料證實(shí)日本是目前 CETP基因缺陷最為頻發(fā)的國(guó)家〔9〕,中國(guó)人該基因變異頻率略低于日本〔10〕,但在歐美白種人和印度人未發(fā)現(xiàn)該基因突變〔11〕。故本研究對(duì)CETP基因的 D442G突變進(jìn)行了分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)三組人群中 HC組和BHC組均檢出 CETP基因 D442G突變GG突變純合子,而在對(duì)照組中則未檢出,與鄭克勤〔12〕的研究結(jié)果一致;而 HC組 D442G突變頻率為 5.3%,與王偉〔13〕報(bào)道的突變率為 6%相接近。本研究還顯示 HC組中GG基因型及 G等位基因頻率明顯高于其余兩組。在 HC組中,GG基因型者血清 TC、LDL-C水平較其他兩組有上升趨勢(shì),CETP水平有下降趨勢(shì);回歸分析顯示高膽固醇的主要危險(xiǎn)因素是 CETP基因 D442G突變GG基因型。以上都說(shuō)明 CETP基因的D442G突變與高膽固醇血癥關(guān)系密切,但該突變?nèi)绾握{(diào)控膽固醇生成尚待進(jìn)一步研究。

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