丁 圣，蔣菁莉，劉松玲，劉愛萍，任發(fā)政,*

長雙歧桿菌BBMN68對便秘模型小鼠的通便作用

丁 圣1，蔣菁莉1，劉松玲2，劉愛萍1，任發(fā)政2,*

(1.蒙牛乳業(yè)(北京)有限責任公司，北京 101107；2.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083)

目的：研究長雙歧桿菌活菌BBMN68活菌液對便秘模型小鼠的潤腸通便作用。方法：將Balb/c雄性小鼠隨機分為空白組、模型組、陽性對照組和3個劑量的給藥組。給藥組分別經(jīng)口給予低、中、高劑量(1×107、1× 108、1×109CFU/mL)的長雙歧桿菌BBMB68活菌液0.1mL/(kg·d)(以體質(zhì)量計)；空白組和模型組給予0.1 mL/(kg·d)的質(zhì)量分數(shù)10%的脫脂奶溶液；陽性對照組給予1×108CFU/mL動物雙歧桿菌菌懸液0.1mL/(kg·d)。用復方地芬諾酯制造小鼠便秘模型，建模后各組分別給藥，觀察各組小鼠的首次排黑便時間、5h內(nèi)排便粒數(shù)和質(zhì)量，測定糞便含水量和小腸墨汁推進率。結(jié)果：長雙歧桿菌BBMN68給藥7d，可明顯改善便秘小鼠首次排黑便時間、增加排黑便粒數(shù)和質(zhì)量；長雙歧桿菌BBMN68給藥15d可顯著提高便秘小鼠小腸墨汁推進率。表明長雙歧桿菌BBMN68具有潤腸通便功能。

雙歧桿菌；通便；小鼠；便秘

根據(jù)FAO/WHO(2002)的定義，益生菌是指由單一或多種微生物組成的活菌，當攝入一定劑量時，能通過改善宿主腸道微生態(tài)平衡來促進人體健康[1]。作為一個有效的益生菌菌種，具有以下特點：來源安全、無致病性、能夠耐受胃酸和膽汁、能黏附于腸黏膜而阻止病原微生物的黏附、有益于人體免疫及其他臨床證實的各種保健功能[2]。目前用于食品的益生菌主要有乳酸菌和雙歧桿菌，調(diào)節(jié)腸道菌平衡是益生菌最直接和最根本的一項功能，本實驗通過便秘小鼠模型研究來源健康人群腸道的長雙歧桿菌BBMN68菌株的潤腸通便功能。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

Balb/c 雄性小鼠，6～8 周齡，體質(zhì)量18～22g，SPF級，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

長雙歧桿菌BBMN68菌株分離至長壽老人糞便(CGMCC.2265)，用MRS液體培養(yǎng)基37℃厭氧培養(yǎng)18h，4000r/min離心10min，菌體沉淀重懸于質(zhì)量分數(shù)10%脫脂乳中，配制不同濃度菌懸液。陽性對照菌株為分離自市售保健酸奶的雙歧桿菌，經(jīng)16S rDNA序列測定鑒定為動物雙歧桿菌，菌株活化及制備方法同長雙歧桿菌BBMN68。

復方地芬諾酯片(批號0811081) 江蘇平光制藥有限公司；活性炭粉 鞏義市嵩山濾材活性碳廠；阿拉伯樹膠 廣東汕頭市西隴化工廠；MRS培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

SW-CJ醫(yī)用型潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；XSZ-G生物顯微鏡 重慶光學儀器廠；ZDX35BI高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；DNP9082恒溫培養(yǎng)箱、DHG-9076A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；3K30 型低溫高速離心機、ACCULAB分析天平 德國Satorious公司。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制

墨汁的配制：準確稱取阿拉伯樹膠100 g，加水800mL，煮沸至溶液透明，稱取活性碳(粉狀)50g加至上述溶液中煮沸3次，待溶液涼后加水定容到1000mL，于冰箱中4℃保存，用前搖勻。

復方地芬諾酯混懸液(0.05g/100mL)的配制：復方地芬諾酯片，每片含復方地芬諾酯2.5mg，取20片用研缽研碎呈粉末后加水至100mL，臨用前配制。

1.2.2 實驗動物分組及處理

實驗設(shè)3個劑量組，空白對照組、陽性對照組和模型對照組?？瞻捉M和模型組小鼠灌胃質(zhì)量分數(shù)10%脫脂乳0.1mL/(kg·d)(以體質(zhì)量計)；低劑量、中劑量、高劑量組小鼠分別灌胃1×107、1×108、1×109CFU/mL的BBMN68菌懸液0.1mL/(kg·d)(以體質(zhì)量計)，陽性對照組小鼠灌胃1×108CFU/mL動物雙歧桿菌菌懸液0.1mL/(kg·d)(以體質(zhì)量計)。每天一次，實驗期間自由進食，記錄各組小鼠體質(zhì)量變化。

1.2.3 小鼠排便實驗[3]

給受試樣品7d后，各組小鼠禁食不禁水16h。模型對照組、陽性對照組和3個劑量組小鼠灌胃給予復方地芬諾酯(10mg/kg)，空白對照組給予蒸餾水。2×107、2×108、2×109CFU/mL 的BBMN68菌懸液及2× 108CFU/mL動物雙歧桿菌菌懸液與墨汁等體積混合，給予復方地芬諾酯0.5h后，空白對照組和模型對照組小鼠灌胃墨汁0.1mL/kg(以體質(zhì)量計)，低、中、高劑量組及陽性對照組給予含受試樣品的墨汁0.1mL/kg(以體質(zhì)量計)，動物均單籠飼養(yǎng)，正常飲水進食。從灌墨汁開始，記錄每只動物首粒排黑便時間、5h內(nèi)排黑便粒數(shù)、質(zhì)量。收集的糞便在105℃烘干至質(zhì)量恒定，測定糞便含水率。

1.2.4 小腸推進實驗[3]

給受試樣品15d后，各組小鼠禁食不禁水16h。模型對照組、陽性對照組和3個劑量組小鼠灌胃給予復方地芬諾酯(5mg/kg)，空白對照組給蒸餾水。給復方地芬諾酯0.5h后，低、中、高劑量組和陽性對照組分別給予含受試樣品的墨汁0.1mL/kg(以體質(zhì)量計)(樣品劑量同1.2.3節(jié)小鼠排便實驗)，其他對照組灌胃墨汁0.1mL/kg (以體質(zhì)量計)。25min后立即脫頸椎處死小鼠，打開腹腔分離腸系膜，剪取上端自幽門、下端至回盲部的腸管，置于托盤上，輕輕將小腸拉成直線，測量腸管長度為“小腸總長度”，從幽門至墨汁前沿為“墨汁推進長度”。按式(2)計算墨汁推進率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

方差分析，需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F值，F(xiàn)值＜F0.05，各組均數(shù)間差異無顯著性；F值≥F0.05，P≤0.05，各組均數(shù)間有顯著差異；用多個實驗組和一個對照組間進行t檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠體質(zhì)量變化

表1 實驗小鼠體質(zhì)量變化(x±s，n=10)Table 1 Body weight of mice during the experiment (x±s，n=10) g

由表1可知，實驗期間，小鼠的體質(zhì)量在各劑量實驗組與各組對照組間比較，均無顯著性差異(P＞0.0 5)，在實驗期間，陽性對照菌株和長雙歧桿菌BBMN68菌株對雄性小鼠的體質(zhì)量無影響。

表3 雙歧桿菌BBMN68對小鼠墨汁推進率的影響n=10)Table 3 Effects of Bifidobacterium strain BBMN68 on the ink propelling rates in mice (n=10)

表3 雙歧桿菌BBMN68對小鼠墨汁推進率的影響n=10)Table 3 Effects of Bifidobacterium strain BBMN68 on the ink propelling rates in mice (n=10)

組別空白組模型組低劑量組中劑量組高劑量組陽性對照組墨汁推進率/%69.27±6.7747.08±12.42▲▲63.08±10.21**59.25±10.21*68.81±11.45**58.61±13.50*

2.2 長雙歧桿菌對小鼠排便的影響

實驗小鼠經(jīng)口灌胃長雙歧桿菌BBMN68菌株，7d后測定對便秘模型小鼠首粒排便時間、5h內(nèi)顆粒、質(zhì)量及糞便含水率的影響，結(jié)果見表2。與空白對照組比較，模型組小鼠首次排黑便時間、5h內(nèi)排便顆粒和排便質(zhì)量均有顯著性差異(P＜0.01)，說明便秘小鼠模型成立。長雙歧桿菌BBMN68給藥7d，各劑量組小鼠糞便顆粒數(shù)均顯著高于模型組(P＜0.05)，中劑量組效果最明顯，達到極顯著水平(P＜0.01)。雙歧桿菌BBMN68中、高劑量組小鼠糞便質(zhì)量顯著高于模型組(P＜0.05)，中劑量組首次排黑便需要的時間明顯低于模型組(P＜0.01)。與陽性對照組比較，長雙歧桿菌BBMN68各劑量組小鼠糞便質(zhì)量、糞便顆粒和糞便含水量無顯著差異(P＞0.05)，長雙歧桿菌BBMN68中劑量組首次排黑便時間數(shù)值明顯比陽性對照組低(P＜0.05)。

表2 長雙歧桿菌BBMN68對便秘小鼠各排便指標的影響(n=10)Table 2 Effects of Bifidobacterium strain BBMN68 on defecation index(，n=10)

表2 長雙歧桿菌BBMN68對便秘小鼠各排便指標的影響(n=10)Table 2 Effects of Bifidobacterium strain BBMN68 on defecation index(，n=10)

注：▲▲.與空白對照組相比，有極顯著性差異(P＜0.01)；*.與模型組相比，有顯著性差異(P＜0.05)；**.與模型組相比，有極顯著性差異(P＜0.01)；■.與陽性對照相比，有顯著性差異(P＜0.05)。下同。

組別糞便質(zhì)量/g首次排黑便時間/min糞便顆粒糞便含水量/%空白組0.949±0.195105.1±24.341.3±966.9±2.7模型組0.637±0.085▲▲153.7±20.0▲▲29.3±4.8▲▲64.1±3.6低劑量組0.730±0.226134.1±31.134±7.8*63.8±3.2中劑量組0.916±0.291*102.3±22.5**■40.8±7.4**67.1±2.7*高劑量組0.820±0.223*132.7±32.135.9±9.2*65.4±3.5陽性對照組0.846±0.171**126.0±9.0**35.9±7.8*68.2±3.2

2.3 小腸推進實驗研究結(jié)果

小腸運動有3種方式，即張力收縮、分節(jié)運動和蠕動，主要以蠕動力推動腸內(nèi)容物運動為主要方式。本實驗經(jīng)口灌胃給予實驗小鼠造模藥物復方地芬諾酯，建立小鼠小腸蠕動抑制模型，通過墨汁標記觀察雙歧桿菌活菌體對便秘小鼠腸道蠕動的影響。實驗小鼠給藥長雙歧桿菌BBMN68活菌液15d，做小腸推進實驗，各組小鼠腸道的墨汁推進率見表3。

由表3可知，模型組墨汁推進率顯著低于空白對照組(P＜0.01)，小鼠便秘模型成立。長雙歧桿菌BBMN68組給藥15d，各劑量組小鼠墨汁推進率均顯著高于模型組，其中低、高劑量組達到極顯著水平(P＜0.01)，與空白對照組接近。長雙歧桿菌BBMN68組小鼠與陽性對照組比較無顯著差異(P＞0.05)。

3 討 論

腸道內(nèi)微生物在胃腸黏膜細胞提供營養(yǎng)中扮演著重要角色。腸道菌群處于微生態(tài)平衡時，腸道中有益菌占優(yōu)勢種群數(shù)量，益生菌具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，調(diào)節(jié)機體免疫功能，增強消化、促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收等生理功效[4]，其中潤腸通便、改善腸道菌群是益生菌最直接和最根本的一項功能。葉虹等[5]研究益生菌制劑對實驗動物的改善胃腸道功能，益生菌制劑具有改善腸道菌群作用，有對抗復方地芬諾酯抑制腸推進作用及其所致的便秘作用。姜淑青等[6]的研究表明功效成分為保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌和長雙歧桿菌的酸奶對人體具有明顯通便功能。Yang等[7]研究了含有雙歧桿菌發(fā)酵酸奶對便秘婦女的潤腸通便功能，便秘人群使用含雙歧桿菌B.lactis DN-173010菌株的酸奶1～2 周，便秘癥狀有所改善。酸奶中含有大量的益生菌，益生菌在體內(nèi)可及時改善腸道菌群失調(diào)，增強人體免疫力，促進腸道菌群的活動。

便秘是一種常見的胃腸功能失調(diào)癥，是許多慢性病的誘因，研究認為增加膳食中的膳食纖維和益生菌可有效地減緩便秘癥狀，益生菌的通便功能與菌株及便秘人群相關(guān)[8]。益生菌的生理功能具有菌株特異性，即不同的菌株、菌種和菌屬具有不同的功能。文獻報道不同菌株發(fā)酵乳對人群便秘和腹瀉癥狀的改善作用，不同來源的植物乳桿菌改善癥狀效果不同[9]。本實驗研究長雙歧桿菌BBMN68 菌株對便秘模型小鼠的潤腸通便功能，采用止瀉劑復方地芬諾酯灌胃建立了小鼠慢性便秘模型，復方地芬諾酯主要是直接作用于腸道平滑肌，通過抑制腸黏膜感受器，消除局部腸黏膜的蠕動反射而使腸道蠕動減慢，使腸內(nèi)容物通過延遲，致使小鼠排便減少或難排便，與便秘臨床癥狀及診斷對比相同[10]。本實驗中小鼠的便秘模型造模成功，通過實驗從小鼠的首次排便時間、排便粒數(shù)和質(zhì)量、糞便水分含量和墨汁推進率等指標評價雙歧桿菌對便秘模型小鼠的通便功能。在本實驗中，長雙歧桿菌BBMN68給藥7d，可明顯改善便秘小鼠首次排黑便時間、增加排黑便粒數(shù)和質(zhì)量；長雙歧桿菌BBMN68組給藥15d可顯著提高便秘小鼠小腸墨汁推進率。表明長雙歧桿菌BBMN68菌株具有潤腸通便功能。從微生態(tài)學觀點認為，當腸道內(nèi)有足夠的益生菌時，益生菌的代謝產(chǎn)物主要為L(+) -乳酸、乙酸和極少量甲酸、丙酸等有機酸類物質(zhì)，這些物質(zhì)對人體的腸壁神經(jīng)有良好的刺激作用，可促進腸管蠕動及增加腸管內(nèi)滲透壓，使水分分泌亢進，從而產(chǎn)生通便功效，起到潤腸通便功能[11]。長雙歧桿菌BBMN68菌株對改善便秘小鼠胃腸功能的機理還有待繼續(xù)研究。

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Effect of Biofidobactria Strain on Defecating Function in Constipation Mice

DING Sheng1，JIANG Jing-li1，LIU Song-ling2，LIU Ai-ping1，REN Fa-zheng2,*
(1. MengNiu Dairy (Beijing) Company, Beijing 101107, China；2. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

The objective of this study was to evaluate the defecating function of Biofidobacterium animal BBMN68 on constipated mice. Male Balb/c mice were randomly divided into control group, model control group, positive control group and 3 dosages groups. Mice of 3 dosages groups were orally administered with different concentrations of live B. BBMN68 (1 × 107, 1 × 108, 1 × 109CFU/mL) at 0.1 mL/(kg·d) dose once a day, and mice of control group as well as model control group were administered with 10% skim milk liquid 0.1mL/(kg·d), while the mice of positive control group with 1 × 108CFU/mL B. animal at 0.1 mL/(kg·d). Mice constipation model was established by using compound diphenoxylate. Each group was respectively treated with corresponding drugs, and then the time of defecation of the first black feces, the character of feces within 5 hours, and the promoting rate of ink were measured. Results: the mice administrated with B. BBMN68 for 7 days had the shorter time of defecation of the first black feces, and the number and weight of mice feces within 5 hours were increased; when the mice were administered with BBMN68 stain for 15 days, the ink propelling rates were increased. Conclusion: B. animal strain BBMN68 strain has the potential defecation function in constipation mice.

bifidobacteria；defecation；mice；constipation

R37； TS201.3

A

1002-6630(2011)03-0195-04

2010-06-01

“十一五”國家科技支撐計劃項目(2006BAD04A06)

丁圣(1968—)，男，高級工程師，主要從事乳品加工研究。E-mail：mndingsheng@126.com

*通信作者，任發(fā)政(1962—)，男，教授，博士，主要從事功能性乳品研究。E-mail：renfazheng@263.net