蘇 茉，高亞朋，梁建榮，黃 潔，唐云明

黑曲霉H1-9b葡萄糖氧化酶的分離純化及部分性質(zhì)研究

蘇 茉，高亞朋，梁建榮，黃 潔，唐云明*

(西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶市甘薯工程研究中心，三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715)

采用研磨法破碎黑曲霉H1-9b菌絲體，經(jīng)pH5.7磷酸緩沖液抽提獲得粗酶液，粗酶液經(jīng)DEAE-Sepharose離子交換層析和Superdex-200凝膠過(guò)濾層析，得到葡萄糖氧化酶純品。該酶的比活力為30569.7U/mg，回收率為30.2%，提純倍數(shù)為41.4倍，分子質(zhì)量為94.1kD，為單亞基酶。該酶最適溫度為37℃，最適pH值為5.7，在30～40℃溫度范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好，在pH4.0～8.0范圍內(nèi)活性穩(wěn)定。以不同濃度葡萄糖為底物在最適條件下測(cè)得該酶Km值為30.69mmol/L，Vmax為21.88μmol/L。Ag+、Cu2+、Zn2+對(duì)該酶活性有較大抑制作用。結(jié)果表明，該酶穩(wěn)定性較好，有一定的應(yīng)用價(jià)值。

黑曲霉；葡萄糖氧化酶；分離；純化；性質(zhì)

葡萄糖氧化酶(glucose oxidase EC 1.1.3.4，GOD)能夠在有氧的情況下催化氧化葡萄糖生成葡萄糖酸[1]。這種酶在自然界中有廣泛分布，在工業(yè)生產(chǎn)中多以黑曲霉、青霉等微生物為主要來(lái)源[2]。葡萄糖氧化酶在食品加工、釀酒[3]及醫(yī)藥衛(wèi)生行業(yè)均有廣泛應(yīng)用[4]，故生產(chǎn)高活性且成本低廉的葡萄糖氧化酶有重要意義。目前用黑曲霉為原材料分離純化葡萄糖氧化酶已有報(bào)道，王志新[5]提純黑曲霉A9的GOD比活力為349.84U/mg，美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)的商品GOD比活力為266.82U/mg，中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所構(gòu)建的重組酵母所產(chǎn)GOD比活力為426.25U/mg[6]，但是酶活力和比活力均不理想。為此，本實(shí)驗(yàn)嘗試用實(shí)驗(yàn)室葡萄糖氧化酶高產(chǎn)菌株黑曲霉H1-9b作為出發(fā)菌株，發(fā)酵生產(chǎn)并分離純化葡萄糖氧化酶，同時(shí)對(duì)其部分性質(zhì)進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 菌種、培養(yǎng)基與試劑

黑曲霉(Aspergillius niger)H1-9b由西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院酶工程實(shí)驗(yàn)室保存。

培養(yǎng)基參考文獻(xiàn)[7]配制。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖80、蛋白胨3、KH2PO42、MgSO4·7H2O 0.7、 KCl 0.5、NaNO34， pH5.5；斜面培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖 30、NaNO32、K2HPO41、KCl 0.5、MgSO40.5、FeSO40.01、瓊脂 20，pH5.5。

DEAE-Sephrose(DEAE-瓊脂糖)、Superdex-200(葡聚糖凝膠)、三羥甲基氨基甲烷(Tris) 香港Farco公司；牛血清白蛋白(bovine seyum albumin)、卵清蛋白(ovalbumin chicken)、胰蛋白酶抑制劑(trypsin inhibtor)、溶菌酶(lysozyme)、藍(lán)色葡聚糖-2000、蛋白質(zhì)SDSPAGE標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Promega公司；載體兩性電解質(zhì) 美國(guó)Bio-Rad公司；丙烯酰胺、甲叉-雙丙烯酰胺 瑞士Fluka公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

MC4L冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Uniequip公司；DYY-Ⅱ型電泳儀 北京六一儀器廠；UV-2550 PC型分光光度計(jì)日本島津公司；BSZ-2型自動(dòng)雙蒸餾水儀 上海博通化學(xué)科技有限公司；高速冷凍離心機(jī) 日本玖保田公司；PHS-32W微電路pH計(jì) 上海理達(dá)儀器廠；Powerlook 2100XL凝膠掃描儀 臺(tái)灣Umax公司；AKTA prime plus蛋白質(zhì)純化系統(tǒng) 美國(guó)GE公司。

1.3 葡萄糖氧化酶的發(fā)酵

1.3.1 種子液培養(yǎng)

在斜面培養(yǎng)基上接種黑曲霉H1-9b孢子，28℃培養(yǎng)4～5d。

1.3.2 搖瓶發(fā)酵

250mL錐形瓶中分裝50mL發(fā)酵培養(yǎng)基，121℃滅菌20min，接種黑曲霉H1-9a孢子濃度為104個(gè)/mL，28℃、200r/min搖床培養(yǎng)80h即達(dá)產(chǎn)酶高峰。

1.3.3 菌絲體的制備

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)完成后，用紗布過(guò)濾發(fā)酵液，收集球狀菌絲體，用雙蒸水將其反復(fù)沖洗，直至把發(fā)酵液沖干凈；再用0.2mol/L pH5.7的磷酸緩沖液沖洗菌絲體，壓干水分，稱(chēng)質(zhì)量后收集備用。

1.4 酶的分離純化

1.4.1 粗酶液的制備

本實(shí)驗(yàn)采用研磨法破碎菌絲體。將菌絲體置于研缽中，加入適量石英砂，對(duì)菌體進(jìn)行研磨；充分研磨后按1:1(m/V)加入預(yù)冷的0.2mol/L pH5.7磷酸緩沖液浸提粗酶，4℃抽提2h。抽提完成后4℃、12000r/min離心20min，取上清液，即為粗酶液，透析1d后收集備用。

1.4.2 DEAE-Sepharose離子交換層析

用300mL 0.05mol/L pH7.1的Tris-HCl緩沖溶液平衡DEAE-Sepharose離子交換層析柱，取5mL粗酶液上樣，用0～1mol/L NaCl(用0.05mol/L，pH7.1的 Tris-HCl緩沖溶液配制)進(jìn)行梯度洗脫，流速0.5mL/min，每管收集5mL，層析完成后收集GOD活性管，透析脫鹽，冷凍干燥后備用。

1.4.3 Superdex-200凝膠過(guò)濾層析

用0.05mol/L pH7.1的Tris-HCl緩沖溶液平衡Superdex-200凝膠過(guò)濾層析柱過(guò)夜，將冷凍干燥后的樣品加水稀釋至2mL上樣，用0.05mol/L pH7.1的Tris-HCl緩沖溶液進(jìn)行洗脫，流速0.3mL/min，每管收集3mL，層析完成后收集GOD活性管，透析脫鹽，冷凍干燥得到GOD純品。

1.5 酶活力的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[8-9]報(bào)道的方法并加以改進(jìn)。取適當(dāng)稀釋后酶液50μL，加入2.0mL 0.1mol/L pH5.7磷酸緩沖溶液，0.3mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%葡萄糖溶液，50μL 16mmol/L 4-氨基安替吡啉，50μL 7.5mmol/L苯酚，50μL過(guò)氧化物酶(1000U/mL)，在37℃準(zhǔn)確反應(yīng)4min，再置于沸水浴中快速滅活4min，冷卻至室溫，在波長(zhǎng)500nm處測(cè)定其吸光度；空白對(duì)照除酶液預(yù)先滅活，其他處理相同。將每分鐘消耗1μmol葡萄糖所需要的酶量定義為一個(gè)活力單位(U)。

1.6 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

用Bradford等[10]方法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.7 GOD分子質(zhì)量測(cè)定

用凝膠過(guò)濾法[11]測(cè)定GOD全分子質(zhì)量，SDS-PAGE法[12]測(cè)定GOD亞基分子質(zhì)量。8% SDS-PAGE分離膠，5%濃縮膠，電泳后用考馬斯亮藍(lán)R-250染色。

1.8 酶的性質(zhì)測(cè)定

1.8.1 最適pH值及pH值穩(wěn)定性

37℃條件下，測(cè)定GOD在不同pH值(4.0～8.0)緩沖溶液中的酶活力；將GOD置于不同pH值(4.0～8.0)緩沖溶液中，測(cè)定25℃保存7d后的酶活力。以最大酶活力為100%，其他條件下酶活力與之相比，計(jì)算相對(duì)酶活力。

1.8.2 最適溫度及熱穩(wěn)定性

分別測(cè)定GOD在不同溫度(20～80℃) 條件下的酶活力，及在30～70℃條件下分別保溫1、2、3、4、5h后的酶活力。以最大酶活力為100%，其他條件下酶活力與之相比，計(jì)算相對(duì)酶活力。

1.8.3 GOD的Km值及Vmax測(cè)定

在最適條件下，以不同濃度(25～75mmol/L)的葡萄糖為底物，測(cè)定其酶活力，并按雙倒數(shù)法(Lineweaver-Burk法[13])作圖，求出其Km值及Vmax。

1.8.4 金屬離子對(duì)酶活性的影響

將GOD與不同的金屬離子溶液混合，使金屬離子的終濃度為1～7mmol/L或0.25～1.5mmol/L，4℃放置30min后，在最適條件下測(cè)定其酶活力，以不加金屬離子的酶活力為100%(作為標(biāo)準(zhǔn)管)，添加金屬離子后的殘酶活力與標(biāo)準(zhǔn)管酶活力之比即為相對(duì)酶活力。金屬離子分別為：Li+、K+、Ag+、Mn2+、Mg2+、Zn2+、Ca2+、Ba2+、Co2+、Cu2+、Pb2+。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖氧化酶的分離純化

粗酶液經(jīng)D E A E-S e p h a r o s e離子交換層析和Superdex-200凝膠過(guò)濾層析洗脫曲線如圖1、2所示，酶的分離純化結(jié)果見(jiàn)表1。從整個(gè)分離純化過(guò)程看，純化效果較好，純化倍數(shù)較高。

圖1 黑曲霉H1-9b所產(chǎn)GOD的DEAE-Sepharose離子交換層析曲線Fig.1 DEAE-Sepharose ion-exchange chromatography of GOD from A. niger H1-9b

圖2 黑曲霉H1-9b所產(chǎn)GOD的Superdex-200凝膠過(guò)濾層析曲線Fig.2 Superdex-200 gel filtration chromatography of GOD from A. Niger H1-9b

表1 黑曲霉H1-9b所產(chǎn)GOD純化結(jié)果Table 1 Purification of GOD from A. niger H1-9b

2.2 酶的純度鑒定

由Superdex-200凝膠過(guò)濾層析純化的酶液經(jīng)SDSPAGE分析，用考馬斯亮藍(lán)R-250染色，呈現(xiàn)單一條帶，說(shuō)明該酶已經(jīng)達(dá)到電泳純(圖3)。

圖3 黑曲霉H1-9b所產(chǎn)GOD的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.3 SDS-PAGE of GOD from A. niger H1-9b

2.3 酶的分子質(zhì)量

經(jīng)Superdex-200凝膠過(guò)濾層析測(cè)得酶的分子質(zhì)量約為94.1kD，經(jīng)SDS-PAGE測(cè)得酶的亞基分子質(zhì)量約為94.0kD，可見(jiàn)黑曲霉H1-9b所產(chǎn)GOD是單亞基酶。

2.4 酶的性質(zhì)鑒定

2.4.1 最適pH值及pH值穩(wěn)定性

圖4 pH值對(duì)黑曲霉H1-9b所產(chǎn)GOD酶活力的影響Fig.4 Effect of pH on the activity of GOD from A. niger H1-9b

由圖4可見(jiàn)，在37℃時(shí)，黑曲霉H1-9b 所產(chǎn)GOD在pH5.7左右活性最強(qiáng)，在pH5.0～7.0范圍內(nèi)酶活力較高，超出此范圍酶活力顯著下降。

圖5 黑曲霉H1-9b所產(chǎn)GOD的pH值穩(wěn)定性Fig.5 pH stability of GOD from A. niger H1-9b

由圖5可見(jiàn)，將酶與不同pH值的緩沖溶液混合，25℃放置7d后，保存在各個(gè)pH值下的GOD相對(duì)酶活力均保持在80%以上，說(shuō)明該酶在pH4.0～8.0范圍內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.2 最適溫度及熱穩(wěn)定性

圖6 溫度對(duì)黑曲霉H1-9b所產(chǎn)GOD酶活力的影響Fig.6 Effect of temperature on the activity of GOD from A. nger H1-9b

圖7 黑曲霉H1-9b所產(chǎn)GOD的熱穩(wěn)定性Fig.7 Thermostability of GOD from A. niger H1-9b

由圖6可見(jiàn)，黑曲霉H1-9b 所產(chǎn)GOD最適溫度為37℃。由圖7可見(jiàn)，該酶在30～40℃具有較好的熱穩(wěn)定性，保溫5h后相對(duì)酶活力在50%左右，超過(guò)50℃后活力損失較大，在70℃保溫5h后酶活力基本喪失。

2.4.3 酶的米氏常數(shù)

以不同濃度葡萄糖為底物，測(cè)得黑曲霉H1-9b所產(chǎn)GOD的Km值為30.69mmol/L，Vmax為21.88μmol/(L·s) (圖8)。

圖8 黑曲霉H1-9b所產(chǎn)GOD的Km值Fig.8 Km of GOD from A. niger H1-9b

2.4.4 金屬離子對(duì)黑曲霉H1-9b所產(chǎn)GOD酶活性的影響

表2 金屬離子對(duì)黑曲霉H1-9b所產(chǎn)GOD酶活力的影響Table 2 Effects of Li+, K+, Mn2+, Mg2+, Ca2+, Ba2+and Pb2+on the activity of GOD from A. niger H1-9b

如表2所示，金屬離子Li+、K+、Mn2+、Mg2+、Ca2+、Ba2+、Pb2+在1～7mmol/L濃度范圍內(nèi)對(duì)黑曲霉H1-9b GOD的活性影響不大，活力均保持在80%以上。而Zn2+、Cu2+、Ag+對(duì)其活性影響較大，抑制作用明顯，見(jiàn)圖9。尤其是Ag+，當(dāng)其濃度達(dá)到1mmol/L時(shí)，GOD活性已經(jīng)完全喪失。Co2+在低濃度下對(duì)GOD有雙重作用，當(dāng)濃度小于1mol/L時(shí)，對(duì)該酶有抑制作用，但隨著濃度的升高，這種抑制作用逐漸減弱。

圖9 Co2+、Zn2+、Cu2+、Ag+對(duì)黑曲霉H1-9b所產(chǎn)GOD酶活力的影響Fig.9 Effects of Co2+, Zn2+, Cu2+and Ag+on the activity of GOD from A. nger H1-9b

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從黑曲霉H1-9b中分離得到GOD純品，該酶的比活為30569.7U/mg，回收率為30.2%，純化倍數(shù)為41.4倍。尤其是在離子交換層析后，酶比活力呈大幅度上升，分離效果較好。張婷[14]、Simpson等[15]純化的GOD均由兩個(gè)亞基組成，酶蛋白分子質(zhì)量分別為160、148kD，而本實(shí)驗(yàn)測(cè)得黑曲霉H1-9b所產(chǎn)GOD的分子質(zhì)量為94kD，且為單亞基酶。這與普遍報(bào)道有所不同，說(shuō)明GOD分子結(jié)構(gòu)在不同來(lái)源的材料中具有特異性。

黑曲霉H1-9b 所產(chǎn)GOD的熱穩(wěn)定性一般，在30～40℃的溫度范圍內(nèi)保溫5h后相對(duì)酶活力在50%以上，在工業(yè)生產(chǎn)中可以在常溫下使用。該酶的pH值(pH4.0～8.0)穩(wěn)定性較高，說(shuō)明該酶的酸堿耐受力好，可在較寬廣的pH值范圍內(nèi)發(fā)揮作用，有較高的應(yīng)用價(jià)值。不同來(lái)源的GOD的Km值差異較大，張茜[16]純化的尼崎青霉菌葡萄糖氧化酶Km值為122.6mmol/L，Rando等[17]報(bào)道的GOD的Km值為6.2mmol/L，本實(shí)驗(yàn)中測(cè)得黑曲霉H1-9b所產(chǎn)GOD的Km值為30.69mmol/L，與王志新[5]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(Km值35.74mmol/L)較為接近，顯示黑曲霉H1-9b所產(chǎn)GOD對(duì)葡萄糖的親和力較好。

Zn2+、Cu2+、Ag+對(duì)黑曲霉H1-9b 所產(chǎn)GOD的活性有抑制作用，而在Kelley 等[18]的實(shí)驗(yàn)中當(dāng)Cu2+達(dá)到10mmol/L時(shí)，GOD活性仍沒(méi)有被抑制。Ag+對(duì)該酶的抑制作用很強(qiáng)，當(dāng)其濃度增加到1mmol/L時(shí)，GOD活性已被完全抑制，故認(rèn)為Zn2+、Cu2+、Ag+是該酶的金屬離子抑制劑。Co2+對(duì)黑曲霉H1-9b 所產(chǎn)GOD的作用比較特殊，當(dāng)Co2+濃度低于1mmol/L時(shí)，GOD的活性受到了抑制，降至85%，而隨著Co2+濃度的逐漸增加，它對(duì)GOD活性的抑制作用減弱，直至其濃度達(dá)到6～7mmol/L時(shí)，GOD的相對(duì)酶活力又上升至100%。其原因可能是：GOD酶分子上對(duì)Co2+有不同的結(jié)合位點(diǎn)，類(lèi)似于許強(qiáng)等[19]用紫外差分吸收光譜技術(shù)研究葡萄糖異構(gòu)酶與金屬離子作用時(shí)得出當(dāng)金屬離子和葡萄糖異構(gòu)酶分子結(jié)合后，每個(gè)酶分子對(duì)金屬離子至少存在強(qiáng)弱兩種結(jié)合位點(diǎn)。據(jù)此推測(cè)GOD與Co2+結(jié)合后，也可能存在強(qiáng)弱結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)Co2+濃度低時(shí)，Co2+與酶分子的強(qiáng)結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，改變了酶的分子結(jié)構(gòu)，但又不足以達(dá)到穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的作用，所以使得酶活力略微下降，當(dāng)濃度升高以后，強(qiáng)弱結(jié)合位點(diǎn)均被占據(jù)，達(dá)到穩(wěn)定酶分子結(jié)構(gòu)的作用，酶活力回升。而在本實(shí)驗(yàn)中涉及的其他金屬離子：Li+、K+、Mn2+、Mg2+、Ca2+、Ba2+、Pb2+則在1～7mmol/L濃度范圍內(nèi)對(duì)該酶活性的影響不大，且未發(fā)現(xiàn)對(duì)GOD活性有明顯激活作用的金屬離子。

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Isolation, Purification and Some Properties of Glucose Oxidase from Aspergillius niger H1-9b

SU Mo，GAO Ya-peng，LIANG Jian-rong，HUANG Jie，TANG Yun-ming*
(Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region, Ministry of Education, Chongqing Sweetpotato Engineering Research Center, School of Life Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

Glucose oxidase (GOD), an H2O2-producing enzyme, was isolated and purified from Aspergillius niger H1-9b through electrophoretic homogeneity, ion-exchange chromatography on DEAE-Sepharose column and Superdex-200 gel filtration chromatography. The purified GOD had a molecular weight of 94.1 kD as a monomer. The specific activity of GOD was 30569.7 U/mg with recovery rate of 30.2% and purification fold of 41.4. The optimal reaction pH and temperature of GOD were 5.7 and 37 ℃, respectively. The GOD displayed an excellent stability under the conditions of 30-40 ℃ and pH 4.0-8.0. The kinetic parameters such as Km and Vmax were 30.69 mmol/L and 21.88μmol/L while using glucose as the substrate. Obvious inhibitory effects of Ag+, Cu2+and Zn2+on the activity of GOD were observed. Therefore, glucose oxidase from Aspergillius niger H1-9b will have wide applications due to its excellent thermostability and stability in wide pH range.

Aspergillius niger H1-9b；glucose oxidase；isolation；purification；property

Q946.5

A

1002-6630(2011)03-0181-05

2010-04-21

重慶市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)科技攻關(guān)項(xiàng)目(CSCT2004AC1012)

蘇茉(1986—)，女，碩士研究生，主要從事蛋白質(zhì)與酶工程研究。E-mail：chaos421@163.com

*通信作者：唐云明(1960—)，男，教授，博士，主要從事蛋白質(zhì)與酶工程研究。E-mail：tbright2008@126.com