鄒立扣，潘 欣，岳愛玲，羅 燕，李 蓓，張 悅，姚 瓊，吳 琦

長根菇菌絲培養(yǎng)、鑒定及氨基酸成分分析

鄒立扣1，潘 欣2,3，岳愛玲1，羅 燕1，李 蓓1，張 悅1，姚 瓊1，吳 琦4,*

(1. 四川農(nóng)業(yè)大學都江堰校區(qū)微生物學實驗室，四川 都江堰 611830；2. 四川農(nóng)業(yè)大學林學院，四川 雅安 625014；3. 成都理工大學旅游與城鄉(xiāng)規(guī)劃學院，四川 成都 610059；4. 四川農(nóng)業(yè)大學生命科學與理學院，四川 雅安 625014)

采用組織分離法，選擇不同培養(yǎng)條件(溫度、pH值)，獲得長根菇的純培養(yǎng)物。掃描電鏡觀測其菌絲體特征，結(jié)合ITS區(qū)序列鑒定菌絲體，用全自動氨基酸分析儀分別測定長根菇子實體、菌絲體氨基酸組成。結(jié)果表明：長根菇菌絲最佳生長溫度為26℃，最佳生長pH值為5.0；菌絲體ITS區(qū)序列與子實體完全一致(850bp)，ITS區(qū)基因片段的分子鑒定簡便、準確，可以作為長根菇菌絲體鑒定的有效手段。長根菇菌絲體、子實體總氨基酸含量分別為18.25%、13.98%，必需氨基酸含量分別為6.97%、5.28%，非必需氨基酸含量分別為11.28%、8.70%，可見長根菇氨基酸種類豐富，營養(yǎng)價值高，長根菇菌絲體可開發(fā)成為功能性運動食品。

長根菇；培養(yǎng)；菌絲；鑒定；I T S區(qū)；氨基酸；

長根菇(Xerula radicata)又名長根小奧德蘑(Oudemansiella radicata (Relhan: Fr.) Singer)、長根金錢菌、露水雞樅菌、長壽菇，隸屬于真菌門、層菌綱、傘菌目、白蘑科、奧德蘑屬，是一種珍稀的食藥用真菌[1-3]。長根菇富含蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪和碳水化合物，味道鮮美，經(jīng)常食用長根菇，可增強機體免疫力。長根菇中含有多種活性成分，如長根菇多糖、抑菌活性物質(zhì)等[4-5]，對其研究主要側(cè)重在培養(yǎng)特性、栽培技術(shù)[6-7]，但對長根菇子實體及菌絲體的分子鑒定、氨基酸組成分析等尚不清楚。鑒于此，本實驗對長根菇的培養(yǎng)特性、菌絲體特征進行研究，結(jié)合分子生物學方法對菌絲體進行鑒定，并利用X射線光電子能譜儀、全自動氨基酸分析儀分析其子實體及菌絲體部分元素含量和氨基酸組成。

1 材料與方法

1.1 材料、培養(yǎng)基與試劑

長根菇子實體采集自四川省阿壩州；大腸桿菌JM109由四川農(nóng)業(yè)大學都江堰校區(qū)微生物學實驗室保存。

PDA固體、PDA液體培養(yǎng)基：用0.1mol/L HCl或0.1mol/L NaOH將培養(yǎng)基pH值分別調(diào)節(jié)為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，經(jīng)高壓滅菌后備用。

DNA分子質(zhì)量標準DL2000、pMD19-T載體、Taq DNA 聚合酶及DNA連接試劑盒 寶生物工程(大連)有限公司；小量膠回收試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JSM-5900LV型掃描電子顯微鏡 日本電子株式會社；HITACHI L-8800全自動氨基酸分析儀 日本Hitachi公司；XSAM800X射線光電子能譜儀 英國Kratos公司；Leica顯微鏡 德國Leica公司；Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng) PCR儀、電泳儀 美國Bio-Rad公司；Eppendorf 5804R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；MaxQ6000氣浴搖振培養(yǎng)箱 美國Thermo公司；小型渦旋振蕩器德國IKA公司；水浴鍋 上海佑柯儀器設(shè)備有限公司；恒溫培養(yǎng)箱 哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 長根菇的分離與培養(yǎng)

取長根菇子實體，去掉表面雜質(zhì)，用無菌水和75%乙醇清洗消毒，各沖洗兩次后分別取菌蓋、菌柄及菌褶培養(yǎng)。用無菌手術(shù)剪剪成約0.5cm×0.5cm 的小菌塊，用質(zhì)量濃度0.1mg/100mL的氯化汞溶液消毒3min，75%乙醇溶液中浸泡1min，用無菌水沖洗2～3次，干凈后用接種針移入PDA固體培養(yǎng)基，分別置于20、22、24、26、28℃不同溫度下恒溫培養(yǎng)，每一溫度設(shè)置4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0不同pH值梯度，保證45%濕度，每天觀察菌絲生長情況。

1.3.2 菌落及菌絲形態(tài)特征

獲得純化菌種后，轉(zhuǎn)接至PDA固體培養(yǎng)基，每日測定其菌落大小，觀察并記錄其菌落特征。掃描電子顯微鏡觀察其菌絲形態(tài)，樣品制備及觀察按孔祥林等[8]報道的方法，取培養(yǎng)菌絲置于蓋玻片上，加4%戊二醛2滴固定5～10min，用濾紙吸掉多余水分，自然干燥。用 Hitachi離子濺射儀噴金提高樣品導(dǎo)電性，條件：真空10Pa，電流15mA，時間80s。用 JSM-5900LV型掃描電鏡，加速電壓20kV。

1.3.3 長根菇菌絲液體培養(yǎng)

將分離純化后的菌絲接種于PDA液體培養(yǎng)基，26℃、160r/min振蕩培養(yǎng)5～7d，8000×g離心5min，收集菌絲體，用吸水紙盡量吸干水分，用無菌水洗滌菌絲體，離心去除上清液，重復(fù)3次后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 長根菇菌絲的ITS區(qū)鑒定

采用改良二次沉淀法[9-10]，分別提取子實體及菌絲體DNA，用超純水將DNA溶解后經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，-20℃保存?zhèn)溆?。采用真菌通用引物ITS4 (5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇) 和ITS5(5＇-GGAA GTAAAA GTCGTAACAAG-3＇)。PCR擴增體系50μL：超純水41μL，10×Buffer (含1.5mmol/L Mg2+)5.0μL，10mmol/L dNTP 1.0μL，引物各1.0μL，模板DNA 0.5μL，TaqDNA聚合酶0.5μL。反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，循環(huán)30次；72℃延伸10min。擴增產(chǎn)物經(jīng)膠回收，連接pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，進行藍白斑篩選和菌落PCR鑒定。將陽性轉(zhuǎn)化子穿刺培養(yǎng)后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，利用Clustalx軟件對測序結(jié)果進行比對分析。

1.3.5 元素分析

將長根菇子實體及1.3.3節(jié)獲得的菌絲體于50℃烘干至質(zhì)量恒定，研制成粉末，用電子天平稱質(zhì)量，待用。使用X射線光電子能譜儀分析元素含量。Al靶(1253.6eV)，X光槍工作在12kV×15mA功率下，分析室本底真空2×10-7Pa，采用FAT方式，譜儀用Cu2P3/2(932.67eV)，Ag3d5/(368.30eV)，Au4f7/2(84.00eV)標樣校正，數(shù)據(jù)采用污染碳C1s(284.8eV)校正。

1.3.6 氨基酸成分分析

將烘干的長根菇子實體、菌絲體粉碎，50℃烘干至質(zhì)量恒定，研制成粉末，用電子天平稱質(zhì)量，待用。取適量試樣，加10mL 6mol/L HCl，排除空氣后110℃條件下水解22～24h。取一定量定容過濾后的水解液，真空除去HCl后以0.02mol/L鹽酸溶解定容后上機檢測。儀器色譜條件：日立2622SC陽離子樹脂色譜柱：4.6mm× 6 0 m m；檢測波長：5 7 0、4 4 0 n m；洗脫液流量：0.4mL/min；反應(yīng)液流量：0.35mL/min；柱溫：57℃；反應(yīng)溫度：1 35℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 長根菇培養(yǎng)及菌絲特征

圖1 長根菇菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of X. radicata

在PDA培養(yǎng)基上接種3d后開始生長，形成圓形的菌落，顏色呈白色，15d后滿皿，在pH5.0、26℃條件下菌絲生長最好(圖1)，與劉姣英[4]報道基本一致。從圖1可知，菌絲白色、蓬松，氣生菌絲旺盛。掃描電子顯微鏡觀測其菌絲形態(tài)，結(jié)果顯示長根菇菌絲生長茂密，菌絲無隔，未觀測到孢子產(chǎn)生(圖2)。

圖2 電鏡下長根菇菌絲形態(tài)Fig.2 SEM image of X. radicata mycelium

2.2 ITS區(qū)序列比較

采用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)Blast工具對測序結(jié)果進行比對分析，結(jié)果表明，本實驗長根菇菌絲體與子實體的ITS區(qū)序列同源率為100%。該序列長度為850bp(圖3)，G+C含量為45.53%，其與基因庫(GenBank)中登錄的已知序列AF321481(X. furfuracea QXW2430)、AY026919 (X. furfuracea RAG490)、FJ596855 (X. furfuracea TENN61671)、DQ494703 (X. furfuraceae AFTOL-ID 538)和AY534119 (O. radicata MKACC 50093) 的同源率在93%～97%之間，進一步證明本實驗成功培養(yǎng)出長根菇菌絲體。

傳統(tǒng)的真菌種類鑒定主要是依據(jù)子實體的特征，部分種類可通過出菇實驗或孢子形態(tài)進行種類鑒定，但時間較長，且很多種類不能用人工培養(yǎng)方法培育子實體或不產(chǎn)生孢子，很少能直接用于種類鑒定[11-12]，而利用rDNA基因的ITS區(qū)段進行PCR擴增及序列分析，已成為目前廣泛用于真菌分類鑒定的方法[13-14]，本實驗表明長根菇菌絲體與子實體的ITS區(qū)序列同源率為100%，與GenBank中序列亦具有較高同源性，可見利用子實體與菌絲體ITS區(qū)序列的序列測定，并比對分析，可用于長根菇菌種的鑒定。

圖3 長根菇子實體及菌絲體ITS區(qū)序列Fig.3 ITS sequence of mycelium and fruiting body of X. radicata cultivated

2.3 元素含量

經(jīng)X射線光電子能譜儀測定，子實體中N、O、C、P元素的質(zhì)量分數(shù)分別為4.04%、25.74%、67.94%、0.87%，菌絲體中N、O、C、P元素的質(zhì)量分數(shù)分別為3.90%、25.82%、68.17%、0.70% (圖 4)。

圖4 X射線光電子能譜圖Fig.4 Element analysis using X-ray photo-electron spectrometer xps

2.4 氨基酸組成

表1 長根菇子實體、菌絲體氨基酸組成與含量Table 1 Amino acids composition in fruiting body and mycelium of X. radicata

由表1可見，本實驗中長根菇子實體及菌絲體中氨基酸種類豐富，含量較高。菌絲體和子實體總氨基酸含量分別為18.25%、13.98%，必需氨基酸含量分別為6.97%、5.28%，非必需氨基酸含量為11.28%、8.70%，各類氨基酸含量均比平菇[15]、白靈菇[16]等要高，必需氨基酸含量占氨基酸總量E/(E+N)的38.19%、37.76%，必需氨基酸與非必需氨基酸含量比值E/N 為0.62、0.61。

子實體及菌絲體中高含量的谷氨酸和天門冬氨酸等鮮味氨基酸賦予了長根菇鮮美的口味，谷氨酸具有促進紅細胞生成、改善腦細胞營養(yǎng)及記憶力減退的生理作用，同時是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)含量最多的非特異性興奮性氨基酸，它參與多種物質(zhì)的代謝調(diào)節(jié)[15,17]。天冬氨酸是微甜味或鮮味氨基酸，使其水溶液呈微甜味[18]。纈氨酸和亮氨酸可促進正常生長，修復(fù)組織，調(diào)節(jié)血糖，并給身體提供能量。賴氨酸和精氨酸能促進兒童生長和發(fā)育。因此，從氨基酸的組成和含量看，長根菇是高氨基酸含量的食用菌佳品，長根菇菌絲體具有與子實體相近的氨基酸含量和種類分布，可為菌絲體的深加工利用提供科學依據(jù)。

3 結(jié) 論

通過對長根菇菌絲體培養(yǎng)、ITS區(qū)序列鑒定及氨基酸組成分析研究表明：長根菇菌絲最佳生長溫度為26℃，最佳生長pH值為5.0，菌絲生長茂密，無隔，無孢子產(chǎn)生，ITS區(qū)基因片段的PCR擴增及測序簡便、快捷，可以作為長根菇菌絲體及菌種鑒定的有效手段，其ITS區(qū)長度約為850bp。長根菇子實體及菌絲體中N、O、C、P的含量相當，子實體及菌絲體氨基酸種類齊全，含量較高，菌絲體、子實體總氨基酸含量分別為18.25%、13.98%，必需氨基酸含量分別為6.97%、5.28%，非必需氨基酸含量為11.28%、8.70%。以上研究結(jié)果不僅豐富了長根菇營養(yǎng)成分基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，而且對其營養(yǎng)機理研究和保健產(chǎn)品開發(fā)具有重要意義，研制功能性運動食品和飲料將是長根菇應(yīng)用研究發(fā)展方向之一。

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Cultivation, Identification and Amino Acid Composition of Xerula radicata

ZOU Li-kou1，PAN Xin2,3，YUE Ai-ling1，LUO Yan1，LI Bei1，ZHANG Yue1，YAO Qiong1，WU Qi4,*
(1. Laboratory of Microbiology, Dujiangyan Campus of Sichuan Agricultural University, Dujiangyan 611830, China；2. College of Forestry, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China；3. College of Tourism and Town and Country Planning, Chengdu University of Technology, Chengdu 610059, China；4. College of Life Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

The mycelium of Xerula radicata was cultivated on PDA plates at different temperatures and pH values. Both morphological and molecular approaches were used to identify the fungi cultivated. The internal transcribed spacer (ITS) region in rRNA gene was cloned and sequenced, and compared with others species in the Genbank. Besides, the amino acids in the fungi cultivated was analyzed using amino acid auto analyzer. The results showed that the optimal cultivation temperature and pH was 26 ℃ and 5.0. The ITS sequence was the same between mycelium and fruiting body. The molecular marker of ITS sequence was necessary and useful. The total amino acids, essential amino acids and nonessential amino acids accounted for 18.25%, 6.97% and 11.28% in the fruiting body, and 13.98%, 5.28% and 8.70% in the mycelium, respectively. Therefore, X. radicata especially its mycelium is nutritious and can be developed into a functional food product.

Xerula radicata；cultivation；mycelium；identification；ITS region；amino acid

Q93.331；Q939.5

A

1002-6630(2011)03-0144-04

2010-04-14

鄒立扣(1979—)，男，副教授，博士，主要從事微生物及分子生物學研究。E-mail：zoulk124@163.com

*通信作者：吳琦(1973—)，男，副教授，博士，主要從事生物化學及分子生物學研究。E-mail：wuqiwq@163.com