唐 棠，黃乾明，楊群峰

紅酵母Y-5產(chǎn)類胡蘿卜素培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽組分的優(yōu)化

唐 棠，黃乾明*，楊群峰

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與理學(xué)院，四川 雅安 625014)

為提高紅酵母菌株Y-5發(fā)酵產(chǎn)類胡蘿卜素的產(chǎn)量，對(duì)培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽組分進(jìn)行優(yōu)化。采用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)從8種無(wú)機(jī)鹽中篩選出對(duì)提高類胡蘿卜素產(chǎn)量具有顯著效應(yīng)的無(wú)機(jī)鹽組分KH2PO4、MgSO4和NaCl。通過(guò)Box-Behnken設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析確定其質(zhì)量濃度為KH2PO4 0.58g/L、MgSO4 0.49g/L、NaCl 0.28g/L時(shí)，菌株的類胡蘿卜素產(chǎn)量達(dá)到14.51mg/L，與未添加無(wú)機(jī)鹽組分培養(yǎng)基相比，類胡蘿卜素產(chǎn)量提高了25.09%。

紅酵母Y-5；類胡蘿卜素；無(wú)機(jī)鹽；Plackett-Burman設(shè)計(jì)；響應(yīng)面分析

類胡蘿卜素(carotenoids)是一類重要的天然色素，在動(dòng)物、植物、真菌、藻類和細(xì)菌中都有發(fā)現(xiàn)，主要化學(xué)成分包括β-胡蘿卜素和γ-胡蘿卜素。類胡蘿卜素作為人和動(dòng)物體內(nèi)的一類重要生物活性物質(zhì)，在增強(qiáng)機(jī)體免疫、防治腫瘤、治療光敏性疾病等方面有重要的作用。在食品、化妝品、醫(yī)藥和飼料添加劑等方面都有著廣泛的應(yīng)用[1-3]。類胡蘿卜素的生產(chǎn)方法主要有天然產(chǎn)物提取和化學(xué)合成。從植物、藻類等中提取類胡蘿卜素容易受到自然條件限制，化學(xué)合成的產(chǎn)品鑒于其自身存在毒性，已不為人們所接受[4]。許多微生物具有合成類胡蘿卜素的能力，紅酵母發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素因其安全無(wú)毒、生產(chǎn)周期短、發(fā)酵易于調(diào)控，其研究日益受到重視。但紅酵母產(chǎn)類胡蘿卜素的產(chǎn)量普遍較低[5]，影響其產(chǎn)量的眾多因素中，培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽組分對(duì)紅酵母菌株的生長(zhǎng)以及類胡蘿卜素產(chǎn)量有重要的作用[6-7]。

利用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)可用最少的試驗(yàn)次數(shù)從眾多考察因素中快速有效地篩選出顯著因素[8]。響應(yīng)面法能夠建立連續(xù)變量曲面模型，對(duì)影響生產(chǎn)過(guò)程的各因素及其交互作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，并對(duì)最優(yōu)結(jié)果進(jìn)行預(yù)測(cè)。與傳統(tǒng)優(yōu)化方法相比，響應(yīng)面法所需的試驗(yàn)組數(shù)更少[9]。這兩種方法目前已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于培養(yǎng)基組分的優(yōu)化。

本實(shí)驗(yàn)采用Plackett-Burman法和響應(yīng)面法對(duì)本實(shí)驗(yàn)室選育的紅酵母菌株Y-5發(fā)酵培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽組分進(jìn)行了優(yōu)化，以提高類胡蘿卜素產(chǎn)量，為紅酵母發(fā)酵產(chǎn)類胡蘿卜素工業(yè)化應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

紅酵母(Rhodotorula sp.)菌株Y-5，由本實(shí)驗(yàn)室分離保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面活化培養(yǎng)基：葡萄糖20g、蛋白胨20g、酵母粉10g、瓊脂20g、蒸餾水1000mL，pH值自然；液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母粉10g、蒸餾水1000mL，pH值自然；發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖50g、蛋白胨8g、酵母粉10g、蒸餾水1000mL，pH5.0。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

將菌種從斜面活化培養(yǎng)基中接入裝有50mL液體種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，28℃、150r/min培養(yǎng)24h后，再將其以10%的接種量接入裝有50mL液體種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，28℃、150r/min培養(yǎng)13h；最后將種子液以10%接種量接入到裝有30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)加入不同種類無(wú)機(jī)鹽組分，28℃、150r/min振蕩培養(yǎng)120h。

1.2.2 生物量與類胡蘿卜素含量測(cè)定

將發(fā)酵液于4000r/min離心10min，移除上清液，將菌體水洗再次離心，所得菌體55℃烘干至質(zhì)量恒定，稱量即為生物量。準(zhǔn)確稱取干菌體0.1g，加6mL 3mol/L HCl于室溫下振蕩提取1h，沸水浴處理4min，迅速冷卻，洗滌菌體，4000r/min離心10min，所得沉淀用6mL丙酮與石油醚(1:1，V/V)混合液在室溫下振蕩提取3～4次至菌體無(wú)色，將各次離心液收集即得類胡蘿卜素提取液。提取液用722型分光光度計(jì)在453nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度[10-12]，并按下式計(jì)算類胡蘿卜素含量。

式中：A453nm為453nm波長(zhǎng)處的吸光度；D為稀釋倍數(shù)；V為提取所用溶劑量體積/mL；0.16為類胡蘿卜素摩爾消光系數(shù)/(mol·cm)-1；m為酵母菌體質(zhì)量/g。

類胡蘿卜素產(chǎn)量/(mg/L)=生物量/(g/L)×類胡蘿卜素含量/(mg/g)

1.2.3 無(wú)機(jī)鹽組分優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)，最陡爬坡設(shè)計(jì)[13]，Box-Behnken設(shè)計(jì)[14]與響應(yīng)面分析法[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選無(wú)機(jī)鹽組分

表1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experimental design

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Experimental design and responses of Plackett-Burman design

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果分析表Table 3 Analysis for results of Plackett-Burman tests

根據(jù)紅酵母菌株生長(zhǎng)以及發(fā)酵特性，選取可能影響紅酵母發(fā)酵產(chǎn)類胡蘿卜素產(chǎn)量的8種無(wú)機(jī)鹽X1(KH2PO4)、X2(Na2HPO4)、X3(MgSO4)、X4(CaCl2)、X5(NaCl)、X6(MgCl2)、X7(NaNO3)和X8(K2SO4)作為Plackett-Burman試驗(yàn)的8個(gè)因素進(jìn)行篩選。其因素水平設(shè)計(jì)見表1，試驗(yàn)結(jié)果見表2，表2數(shù)據(jù)利用Minitab 15軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表3。由表3可知，X1(KH2PO4)、X3(MgSO4)和X5(NaCl)對(duì)紅酵母發(fā)酵類胡蘿卜素產(chǎn)量有顯著影響，可信度在95%以上。且KH2PO4、MgSO4、NaCl對(duì)類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響均為正效應(yīng)，應(yīng)提高其實(shí)際水平。

2.2 最陡爬坡設(shè)計(jì)及結(jié)果

為了建立有效的響應(yīng)面擬合方程，必須對(duì)Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出的顯著影響因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，從而逼近類胡蘿卜素最大產(chǎn)量區(qū)。根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果，顯著因素KH2PO4、MgSO4和NaCl的質(zhì)量濃度變化方向及步長(zhǎng)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表4，由于3種組分均表現(xiàn)為正效應(yīng)，所以取高水平。

表4 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Experimental design and results of steepest ascent

由表4可知，當(dāng)KH2PO40.6g/L、MgSO40.5g/L、NaCl 0.25g/L時(shí)，對(duì)應(yīng)的類胡蘿卜素產(chǎn)量達(dá)到最大值，故以試驗(yàn)組5對(duì)應(yīng)無(wú)機(jī)鹽組分的質(zhì)量濃度作為B o x-Behnken試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

2.3 響應(yīng)面分析法確定顯著因素的最佳水平

表5 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平表Table 5 Variables and levels in RSM

表6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 6 Experimental design and response of Box-Behnken design

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)分析結(jié)果，確定了具有顯著影響的無(wú)機(jī)鹽組分以及響應(yīng)面試驗(yàn)中心點(diǎn)。響應(yīng)面因素和水平設(shè)計(jì)如表5所示。根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)原理，設(shè)計(jì)三因素三水平共15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，其中12個(gè)是析因點(diǎn)，3個(gè)零點(diǎn)重復(fù)試驗(yàn)用于估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差，每組實(shí)驗(yàn)3個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表6。以類胡蘿卜素產(chǎn)量(Y)為響應(yīng)值，運(yùn)用Minitab軟件進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到52.66，方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.9522，P=0.008，剩余標(biāo)準(zhǔn)差s=0.2177，說(shuō)明該回歸方程具有較好的擬合度。回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)及方差分析見表7、8。

表7 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 7 Significance test of each coefficient of developed quadratic regression model

表8 回歸方程方差分析Table 8 ANOVA analysis for regression equation

由表7、8可知，回歸方程一次項(xiàng)、二次項(xiàng)的影響均超過(guò)了顯著水平。交互項(xiàng)(X1X3、X3X5)影響顯著，說(shuō)明KH2PO4與MgSO4、MgSO4與NaCl的交互作用對(duì)紅酵母發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素產(chǎn)量影響顯著。圖1、2為響應(yīng)面分析的響應(yīng)面圖以及等高線圖。對(duì)回歸方程進(jìn)行求解，可知當(dāng)X1(KH2PO4)為0.58g/L，X3(MgSO4)為0.49g/L，X5(NaCl)為0.28g/L時(shí)，類胡蘿卜素產(chǎn)量(Y)極大值為14.57mg/L。為檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)結(jié)果，在該條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，得類胡蘿卜素產(chǎn)量平均值為14.51mg/L，與模型預(yù)測(cè)結(jié)果接近，說(shuō)明培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽組分優(yōu)化有效。與未加無(wú)機(jī)鹽組分的培養(yǎng)基相比，紅酵母發(fā)酵類胡蘿卜素產(chǎn)量提高了25.09%。

圖1 KH2PO4與MgSO4對(duì)類胡蘿卜素產(chǎn)量影響的響應(yīng)面圖(a)及等高線圖(b)Fig.1 Response surface and contour plots showing the effects of KH2PO4and MgSO4on carotenorid production

圖2 MgSO4與NaCl對(duì)類胡蘿卜素產(chǎn)量影響的響應(yīng)面圖(a)及等高線圖(b)Fig.2 Response surface and contour plots showing the effects ofMgSO4 and NaCl on carotenorid production

3 結(jié) 論

通過(guò)Plackett-Burman試驗(yàn)分析了紅酵母發(fā)酵產(chǎn)類胡蘿卜素培養(yǎng)基中8種無(wú)機(jī)鹽組分對(duì)類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響，篩選出了具有顯著影響的3種無(wú)機(jī)鹽組分：KH2PO4、MgSO4和NaCl。采用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法確定，當(dāng)KH2PO4為0.58g/L、MgSO4為0.49g/L、NaCl為0.28g/L時(shí)類胡蘿卜素產(chǎn)量為14.57g/L。通過(guò)對(duì)預(yù)測(cè)模型試驗(yàn)驗(yàn)證，類胡蘿卜素產(chǎn)量為14.51g/L，與模型預(yù)測(cè)值接近。在此優(yōu)化條件下，與未添加無(wú)機(jī)鹽組分培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵相比，類胡蘿卜素產(chǎn)量提高了25.09%。

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Optimization of Mineral Salts in Fermentation Medium for Carotenoid Production by Rhodotorula Y-5

TANG Tang，HUANG Qian-ming*，YANG Qun-feng
(College of Biology and Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

In order to improve the yield of carotenoid in the fermentation of Rhodotorula Y-5, mineral salts in the fermentation medium were optimized. KH2PO4, MgSO4and NaCl were found to be the important factors affecting carotenoid production significantly by the analysis of Plackett-Burman design. The optimization results based on Box-Behnken design and response surface methodology showed that the production of carotenoid could reach 14.51 mg/L, when KH2PO4 was added at 0.58 g/L, MgSO4 at 0.49 g/L, and NaCl at 0.28 g/L. Compared with the control medium without added mineral salts, the production of carotenoid was increased by 25.09%.

Rhodotorula Y-5；carotenoid；mineral salt；Plackett-Burman design；response surface methodology

TQ920.1

A

1002-6630(2011)03-0130-04

2010-06-10

四川省教育廳重點(diǎn)科研項(xiàng)目(08ZA053)；四川農(nóng)業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目(00731200)

唐棠(1983—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锇l(fā)酵。E-mail：tangtang6@163.com

*通信作者：黃乾明(1964—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸锘瘜W(xué)。E-mail：hqming@sicau.edu.cn