張德利 徐貝貝 李春輝

承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，河北 承德 067000

胃癌（gastric carcinoma）是我國常見的惡性腫瘤之一，在我國其發(fā)病率居各類腫瘤的首位，然而關(guān)于胃癌的發(fā)病機(jī)制目前尚未明確，因此胃癌的發(fā)生和發(fā)展的研究即發(fā)病機(jī)制的研究就成為了目前的研究重點(diǎn)。微管相關(guān)蛋白（microtubule associated protein，MAP）是結(jié)合于微管上的非微管結(jié)構(gòu)蛋白，目前，已發(fā)現(xiàn)和提純的MAP主要有MAP-1、MAP-2、MAP-4和Tau蛋白等幾種[3]。它們參與微管的組裝，維持微管的穩(wěn)定和微管與其他骨架纖維間的連接，表現(xiàn)出廣泛的功能性作用。Tau蛋白即微管聚合蛋白與微管結(jié)合，能誘導(dǎo)微管成束，增強(qiáng)微管的穩(wěn)定性[4]。Tau蛋白是細(xì)胞骨架的重要成分，細(xì)胞骨架發(fā)生異常變化，從而造成細(xì)胞黏附能力下降，運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)等，引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化為腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，Tau是有絲分裂期紡錘體的主要成分，它可使腫瘤細(xì)胞周期順利進(jìn)行，為腫瘤細(xì)胞無限增殖提供條件，加速惡性腫瘤的進(jìn)展。關(guān)于Tau蛋白在胃癌中的免疫組織化學(xué)的研究國內(nèi)外已經(jīng)有報(bào)道，然而關(guān)于Tau mRNA在胃癌中的表達(dá)及與臨床病理間的關(guān)系的研究目前未見報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

標(biāo)本的收集：收集承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2008年12月～2010年3月手術(shù)切除病變組織及正常胃組織（距離腫瘤10 cm以上認(rèn)為正常胃組織），組織厚度＞4 mm，標(biāo)記后立即投入液氮中保存，其中胃癌組織標(biāo)本60例，正常胃組織10例。60例胃癌患者中，男49例，女11例，年齡43～77歲，平均（58.3±10.0）歲；高中分化者28例，低分化者32例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者25例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者35例。

1.2 材料與儀器設(shè)備

Trizol試劑，異丙醇，乙醇；AMV反轉(zhuǎn)錄試劑和盒，PCR擴(kuò)增試劑盒，瓊脂糖，溴化乙錠（EB），超速離心機(jī)，Bio-mini紫外分光光度計(jì)，PCR擴(kuò)增儀，2020D凝膠成像系統(tǒng)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 RNA組織的提取 研缽先預(yù)冷，將組織從液氮罐中取出放入研缽中細(xì)磨，每例標(biāo)本質(zhì)量控制為100 mg，邊研磨邊加液氮，組織研磨至粉末狀后加入Trizol試劑1 mL，將其用鑰匙擊碎，移入1.5 mL的EP管內(nèi)于室溫下融化，靜置5 min后在4℃的溫度下進(jìn)行10 min離心12000 g。上清移置新EP管內(nèi)，加入0.2 mL氯仿，劇烈振蕩15 s后于室溫靜置5 min，4℃的溫度下進(jìn)行10 min離心12000 g，移取約200μL的上層水相到新的1.5 mL EP管中，待RNA沉淀完，加入約200μL的異丙醇，顛倒混勻10余次，室溫沉淀10 min后4℃的溫度下進(jìn)行10 min離心12000 g，棄去上清液，加入1 mL預(yù)冷的78%的乙醇，4℃進(jìn)行5 min離心7500 g，RNA洗滌2次；棄上清液，溶解RNA，10～15 min的空氣干燥后加入20μL DEPC水，57℃水浴孵育10 min。

1.3.2 RNA的檢測(cè) 采用瓊脂糖凝膠電泳方法來檢測(cè)RNA的完整性；1%瓊脂糖凝膠用Tris-乙酸（TAE）配制，加電泳緩沖液Tris-乙酸（1×TAE），每加樣孔加4μL RNA樣品，進(jìn)行 40 min 60 V的電泳；分光光度計(jì)檢測(cè)，波長(zhǎng)設(shè)定230 nm、260 nm、 280 nm，分別測(cè)定RNA樣品在設(shè)定波長(zhǎng)時(shí)的OD值，計(jì)算OD260/OD280，檢測(cè)RNA的純度及濃度。

1.3.3 反轉(zhuǎn)錄過程 在冰浴的管中加入如下組分：RNA 1000 ng，Oligo（dT）15（0.05μg/μL）1μL，無RNA 酶水定容至11μL，輕輕混勻后離心3 s；反應(yīng)混合物在放于PCR儀中70℃5 min，立即置于冰上，冰浴30 s，離心3 s；在試管中加入如下組分 5×Reaction Buffer 4μL，RNase Inhibitor（20 U/μL）1μL，dNTP Mix（10 mmol/L）2μL，混勻，離心，放于 PCR 儀中 37℃，5 min，冰浴 30 s，離心 3 s；加入 AMV RT（10 U/μL）2μL，終體積 20μL，放于 PCR 儀中 37℃，60 min；70℃ 10 min結(jié)束反應(yīng)，置于冰上進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）Tau上游引物（5’to 3’）：GTGACCCAAGAGCCTGAAAGT；Tau下游引物（5’to 3’）：GGTGCAGGTCTCCTAGAAGC；50 bp DNA Ladder購自北京天根生化有限公司（MD108）。冰浴中，在管中加入如下組分：上游引物（10μM）1μL，下游引物（10μM）1μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5μL，cDNA模板（500 ng-1μg/μL）1μL，加ddH2O至25μL，β-actin循環(huán)設(shè)置：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性 45 s，58 ℃退火 45 s，72℃延伸 30 s，循環(huán) 31 次；72℃最終延伸10 min結(jié)束反應(yīng)。產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。

E-cad循環(huán)設(shè)置：95℃預(yù)變性 5 min；95℃變性 45 s，60℃退火45 s，72℃延伸30 s，循環(huán)40次；72℃最終延伸10 min結(jié)束反應(yīng)。產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。

Tau循環(huán)設(shè)置：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性45 s，69℃退火45 s，72℃延伸30 s，循環(huán)40次；72℃最終延伸10 min結(jié)束反應(yīng)。產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。

1.3.5 RT-PCR檢測(cè) Tau mRNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析，取PCR產(chǎn)物10μL用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)EB染色后，在紫外熒光數(shù)字成像儀下照像并進(jìn)行光密度定量分析。以每例E-cad和Tau蛋白分別與其相應(yīng)β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物條帶累積光密度（IOD）的比值作為E-cad mRNA和Tau mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)資料的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理通過SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件完成，計(jì)量資料用（）表示，采用兩獨(dú)立樣本 t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)論

2.1 正常胃組織與胃癌組織中Tau mRNA的表達(dá)

10例正常胃組織Tau mRNA的相對(duì)含量為（0.53±0.01）；60例胃癌組織 Tau mRNA 的相對(duì)含量為（0.78±0.08）， 胃癌組織Tau mRNA的相對(duì)含量明顯高于正常胃組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；高中分化者Tau mRNA的相對(duì)含量為（0.70±0.03）；低分化者Tau mRNA的相對(duì)含量為（0.86±0.02），低分化者Tau mRNA的相對(duì)含量明顯高于高中分化者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。Tau mRNA在正常胃組織中的表達(dá)見圖1。

表1 Tau mRNA在正常胃組織以及胃癌組織中的表達(dá)（）

表1 Tau mRNA在正常胃組織以及胃癌組織中的表達(dá)（）

組別 n IOD P正常胃組織 10 0.53±0.01＜0.05胃癌 60 0.78±0.08分化程度高中分化 28 0.70±0.03＜0.05低分化 32 0.86±0.02

2.2 胃癌組織中Tau mRNA的表達(dá)與臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系

60例胃癌組織中無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者Tau mRNA的相對(duì)含量為（0.74±0.07）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者Tau mRNA的相對(duì)含量為（0.81±0.08），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者Tau mRNA的相對(duì)含量明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），TNM分期Ⅰ+Ⅱ期Tau mRNA的相對(duì)含量為（0.16±0.17），Ⅲ+IV期Tau mRNA的相對(duì)含量為（0.33±0.19），Ⅲ+IV期 Tau mRNA的相對(duì)含量明顯高于Ⅰ+Ⅱ期（P＜0.05），Tau mRNA含量在不同年齡、性別、病變長(zhǎng)度中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。Tau mRNA 在高中分化胃癌中的表達(dá)見圖2。Tau mRNA在低分化胃癌中的表達(dá)見圖3。

表2 不同臨床病理特點(diǎn)胃癌組織中Tau mRNA的表達(dá)（）

表2 不同臨床病理特點(diǎn)胃癌組織中Tau mRNA的表達(dá)（）

組別 n IOD P年齡（歲）＞0.05≤60 33 0.29±0.11＞60 27 0.35±0.20性別男49 0.26±0.13 ＞0.05女11 0.26±0.12大小≤5 cm 37 0.24±0.17 ＞0.05＞5 cm 23 0.21±0.18淋巴轉(zhuǎn)移未轉(zhuǎn)移 25 0.74±0.07 ＜0.05轉(zhuǎn)移 35 0.81±0.08 TNM分期Ⅰ+Ⅱ期 32 0.16±0.17 ＜0.05Ⅲ+Ⅳ期 28 0.33±0.19

圖1 Tau mRNA 在正常胃組織中的表達(dá)

圖2 Tau mRNA 在高中分化胃癌中的表達(dá)

圖3 Tau mRNA在低分化胃癌中的表達(dá)

3 討論

微管結(jié)合蛋白（microtubule associated proteins，MAPs）分子至少包含一個(gè)結(jié)合微管的結(jié)構(gòu)域和一個(gè)向外突出的結(jié)構(gòu)域。突出部位伸到微管外與其他細(xì)胞組分，MAP的主要功能：①促進(jìn)微管聚集成束；②增加微管穩(wěn)定性或強(qiáng)度；③促進(jìn)微管組裝。包括Ⅰ型和Ⅱ型兩大類，Ⅰ型對(duì)熱敏感，如MAP1a、MAP1b，主要存在于神經(jīng)細(xì)胞。Ⅱ型熱穩(wěn)定性高，包括MAP2a、b、c，MAP4和Tau蛋白。細(xì)胞內(nèi)微管蛋白分為α、β兩個(gè)亞型，是細(xì)胞骨架的重要組成部分，它擔(dān)負(fù)著維持細(xì)胞形態(tài)，進(jìn)行物質(zhì)交換，傳遞信息，參與有絲分裂等的重要功能，微管蛋白是真核細(xì)胞中普遍存在的結(jié)構(gòu)，中心體異常和染色體不穩(wěn)定是腫瘤細(xì)胞的普遍特征，中心體微管蛋白較其他功能微管蛋白隨細(xì)胞周期變化活躍。有研究表明癌細(xì)胞的中心體數(shù)目多，具有更強(qiáng)的微管成核能力，中心體異常更為顯著。許多研究表明腫瘤中Tau表達(dá)增加，Tau表達(dá)的增加，則會(huì)加快腫瘤的生長(zhǎng)加速，而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，關(guān)于Tau蛋白的研究多傾向于神經(jīng)系統(tǒng)[5-8]，胃癌中未見涉及，但筆者從它的生物學(xué)功能可以看出，Tau蛋白與微管結(jié)合，能誘導(dǎo)微管成束，增強(qiáng)微管的穩(wěn)定性，微管是有絲分裂期紡錘體的主要成分，它可使細(xì)胞周期可以順利進(jìn)行，為癌細(xì)胞無限增殖提供條件[9-10]。Tau蛋白正是輔助微管的這種作用，加速惡性腫瘤的進(jìn)展。任峰等[11]通過實(shí)時(shí)定量PCR、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞技術(shù)等探討胃癌細(xì)胞的Tau基因表達(dá)與紫杉醇治療敏感性間的關(guān)系。結(jié)果顯示：紫杉醇對(duì)Tau基因表達(dá)低的胃癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖抑制作用，且更能促進(jìn)其凋亡，提示Tau蛋白在胃癌組織中可能表達(dá)增高，這一結(jié)果同筆者的研究結(jié)果相同。筆者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Tau mRNA在正常胃組織中的表達(dá)低于在胃癌組織中的表達(dá)，高中分化胃癌組織Tau mRNA的表達(dá)低于低分化胃癌組織，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織Tau mRNA的表達(dá)低于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且與胃癌的分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示Tau在胃癌組織的mRNA水平出現(xiàn)異常，與腫瘤的分化程度，有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。筆者對(duì)正常胃組織及胃癌組織中Tau mRNA進(jìn)行研究，這對(duì)于了解胃癌的發(fā)生機(jī)制及預(yù)后的判斷，都具有重要的參考意義，同時(shí)隨著微管的性質(zhì)和功能不斷地被闡明，抗腫瘤活性是否也來自于微管抑制劑對(duì)其動(dòng)態(tài)不穩(wěn)定性的影響尚需深人研究，微管仍是抗腫瘤藥物研究的一個(gè)熱門靶點(diǎn)，也必定會(huì)產(chǎn)生更多的有顯著抗腫瘤作用的微管抑制劑。

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