黃 儉 陳志偉 王軍峰

1.上海高鏡鎮(zhèn)社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，上海 200435；2.上海執(zhí)誠(chéng)生物技術(shù)有限公司，上海 201204

近年來研究表明胱抑素C（Cys c）在評(píng)估腎小球過濾速度（GFB）中優(yōu)于血肌酐，Cys c在檢測(cè)方法上已從非均相法發(fā)展到自動(dòng)化快速均相檢測(cè)法，顆粒增強(qiáng)透射免疫比濁法是以多克隆抗體為基礎(chǔ)的改良免疫比濁分析法，整個(gè)分析過程只需幾分鐘，可利用生化分析儀進(jìn)行比濁測(cè)定，這些研究為Cys c在臨床廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)[1-2]。溯源是通過一條具有規(guī)定不確定度的不間斷的比較鏈，使測(cè)量結(jié)果或測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)的值能夠與規(guī)定的參考標(biāo)準(zhǔn)，通常是與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)聯(lián)系起來的特性[3]。用于體外診斷的醫(yī)學(xué)器具，歐盟指出“溯源性”為具體的必備條件之一[4]。因此對(duì)體外診斷試劑進(jìn)行溯源性分析是必然的趨勢(shì)。

測(cè)量不確定度表示指南（GUM）[5]是由國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織（ISO）、國(guó)際電工委員會(huì)（IEC）、國(guó)際計(jì)量局（BIPM）、國(guó)際法制計(jì)量組織（OIMI）、國(guó)際理論化學(xué)與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)（IUPAC）、國(guó)際理論物理與應(yīng)用物理聯(lián)合會(huì)（IUPAP）、國(guó)際臨床化學(xué)聯(lián)合會(huì)（IFCC）等7個(gè)最具權(quán)威性的國(guó)際學(xué)術(shù)團(tuán)體聯(lián)合公布的標(biāo)準(zhǔn)。我國(guó)在1999年將其等同轉(zhuǎn)換為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，編號(hào)為JJF1059-1999[6]。根據(jù)這一標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度的定義是：表征合理賦予被測(cè)量之值的分散性，與測(cè)量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)。為了使IVD試劑溯源過程更加容易理解，使溯源過程更具可操作性，本研究在不違背原定義的情況下將其解釋為：在某概率下，測(cè)量值的估計(jì)區(qū)間與真實(shí)值的估計(jì)區(qū)間之間最大的差距。這一差距涵蓋了被測(cè)量值的分散性，分散性越大不確定度越大。

目前溯源理論和技術(shù)已經(jīng)成熟，有很多研究可以借鑒[7-8]。但是體外診斷試劑又有其特殊性，因?yàn)樵谶M(jìn)行分析之前，首先要對(duì)測(cè)量系統(tǒng)進(jìn)行校準(zhǔn)（定標(biāo)），以消除系統(tǒng)誤差。然而，定標(biāo)品存在的不確定性，往往被人們忽略。本研究正是考慮了這一實(shí)際情況，并結(jié)合胱抑素C試劑盒定標(biāo)的特點(diǎn)，提出了一個(gè)比較合適的方法用來評(píng)估定標(biāo)過程引入的誤差，從而使試劑的不確定度更加完整。

1 材料與方法

1.1 儀器

紫外可見分光光度計(jì)（型號(hào)：日本島津2450）；BioRAD移液槍（20 μL）；Appendof移液槍（200 μL）；Appendof移液槍（1000μL）

1.2 試劑

胱抑素C（膠乳顆粒增強(qiáng)免疫比濁法）試劑盒（DENUO）；胱抑素C定標(biāo)品（denka seiken co.，LTD），其不確定度由廠商提供。見表1。

表1 胱抑素C試劑盒定標(biāo)品含量及其不確定度

以上定標(biāo)品的不確定度可溯源至 DAKO Cytomation CystatinC Calibrator（product code：X0974， Cys-c 7.5 mg/L）。

1.3 溯源方法

不確定度計(jì)算過程一般包括：定義模型以確定輸入和輸出參數(shù)之間的關(guān)系；確定輸入量Xi的估計(jì)值xi；評(píng)估xi的不確定度u（xi）；計(jì)算輸出量和與之關(guān)聯(lián)的不確定度；計(jì)算擴(kuò)展不確定度；輸出測(cè)量結(jié)果。其中不確定度傳遞見公式1。

2 結(jié)果

2.1 完成定標(biāo)曲線

取5個(gè)校準(zhǔn)品和水進(jìn)行6點(diǎn)定標(biāo)：以O(shè)D值為橫坐標(biāo)，以已知的胱抑素C濃度為縱作標(biāo)，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。見圖1。為了計(jì)算定標(biāo)過程的不確定度，筆者對(duì)定標(biāo)品重復(fù)取樣5次，并進(jìn)行測(cè)量，因此每點(diǎn)是5個(gè)取樣值的平均。由圖1可知，使用4次非線性回歸可以取得最好的效果，擬合常數(shù)R=0.9998。擬合方程的形式為公式1。

2.2 校準(zhǔn)模型不確定度的估計(jì)

通過統(tǒng)計(jì)軟件，一方面可以完成對(duì)曲線的擬合，計(jì)算出模型參數(shù)值，同時(shí)也可以給出參數(shù)估計(jì)值范圍和模型期望值范圍。見表2、圖2。

圖1 胱抑素C濃度與吸光值關(guān)系圖

表2 輸入?yún)?shù)及其不確定度（μL）

圖2 胱抑素C濃度與OD關(guān)系

軟件計(jì)算出來的誤差范圍很大，是因?yàn)椴荒芙o軟件提供最精練的計(jì)算公式，因此它會(huì)反復(fù)迭代利用輸入?yún)?shù)，導(dǎo)致參數(shù)和模型的不確定度呈幾何放大，因此軟件計(jì)算出的不確定度與實(shí)際情況不符合。為了在溯源過程中能夠考慮校準(zhǔn)過程帶來的不確定度，筆者提供了一個(gè)比較簡(jiǎn)單的估算方法：首先計(jì)算每個(gè)定標(biāo)點(diǎn)的5個(gè)重復(fù)值的濃度估計(jì)區(qū)間和吸光值的估計(jì)區(qū)間（本研究都是在α=0.05時(shí)進(jìn)行區(qū)間估計(jì)），這樣就得到了6組區(qū)間值，然后分別使用6組的最小值和最高值兩兩組合，進(jìn)行曲線擬合，這樣便可得到4組擬合參數(shù)。見表3。之后將測(cè)量的吸光值分別代到這4個(gè)方程中，這樣計(jì)算出的濃度便是在4種可能的定標(biāo)模型下的結(jié)果。然后再對(duì)這些可能的濃度進(jìn)行區(qū)間估計(jì)。最后計(jì)算樣品區(qū)間與可能的真值區(qū)間之間最大的距離，這個(gè)最大距離就是在α=0.05時(shí)樣品濃度的分布范圍，既不確定度。參考值區(qū)間可以通過計(jì)算定標(biāo)品和儀器引入的誤差進(jìn)行計(jì)算。見表4。

2.3 試劑測(cè)量總不確定度估計(jì)

在試驗(yàn)中筆者通過混合校準(zhǔn)品得到胱抑素C濃度為1.0 mg/L混合“標(biāo)準(zhǔn)品”，再對(duì)其進(jìn)行5次檢測(cè)。然后計(jì)算這些值的估計(jì)區(qū)間，再將區(qū)間上限和下限代入以上4個(gè)公式，計(jì)算出8個(gè)檢測(cè)值，然后對(duì)這8個(gè)值進(jìn)行區(qū)間估計(jì)，得到計(jì)算值的范圍。見表5。

表3 定標(biāo)模型參數(shù)擬合值

表4 校準(zhǔn)品經(jīng)過處理后的濃度范圍（mg/L）

表5 總不確定度及擴(kuò)展不確定度計(jì)算結(jié)果

因此，本試劑在測(cè)量1.0 mg/L樣本時(shí)的擴(kuò)展不確定度為12.8%。

根據(jù)以上溯源方法，筆者對(duì)另外一批胱抑素C試劑進(jìn)行了溯源：混合樣本理論濃度為0.75和4.5 mg/L時(shí)，測(cè)量結(jié)果的擴(kuò)展不確定度分別為15.0%和4.8%。結(jié)果表明，試劑在不同濃度下的不確定度是不同的，主要是因?yàn)椴煌臉颖菊`差不同，另外定標(biāo)品的誤差傳遞到定標(biāo)曲線上，在定標(biāo)曲線上不同的位置會(huì)有不同的不確定度。

3 討論

3.1 模型成立假設(shè)條件

①純水中不含有胱抑素C；②在溯源過程一些條件，如溫度、濕度、壓力基本符合要求，整個(gè)測(cè)量過程時(shí)間較短，假設(shè)這些因素的波動(dòng)不引入隨機(jī)誤差；③由于在測(cè)量之前對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行了校準(zhǔn)，因此系統(tǒng)誤差會(huì)顯著降低，本研究假設(shè)系統(tǒng)誤差為0。

3.2 定標(biāo)曲線對(duì)測(cè)量結(jié)果的影響

在溯源過程中如果不考慮定標(biāo)曲線模型對(duì)計(jì)算結(jié)果的影響，必然對(duì)溯源的可靠性帶來不利影響，使計(jì)算的不確定度偏低。本研究分析了軟件提供的誤差與實(shí)際存在很大差距的原因是數(shù)據(jù)的反復(fù)迭代使用，因此很難直接計(jì)算出模型參數(shù)的誤差。在這樣的環(huán)境下，本研究提供了一個(gè)操作性很強(qiáng)的用于估計(jì)校準(zhǔn)過程引入誤差的方法，通過使用這一方法筆者完成了胱抑素C的溯源性分析。

3.3 試劑測(cè)量過程的不確定度

試劑的不確定度反映了分析結(jié)果的分散性，本研究將其解釋為：在某概率下，可能的測(cè)量值與可能的真實(shí)值之間最大的差距，這一闡釋在沒有違背原定義的情況下，使溯源過程更加容易理解，增強(qiáng)了IVD試劑溯源過程的可操作性。試驗(yàn)證明測(cè)定不同濃度的樣本，不確定度會(huì)不同，這并不能說明被檢試劑性能不穩(wěn)定，因?yàn)檫@個(gè)差距往往來自于不確定度互不相同的定標(biāo)品之間。另外仍需說明，某次的溯源結(jié)果并不能代表整個(gè)試劑全部使用過程的不確定度，因?yàn)椴僮鞑煌?，使用的儀器不同，使用的定標(biāo)方法不同，都可能引入大小不一的誤差。

綜上所述，本研究提出了一個(gè)適用于解決體外診斷試劑溯源的方法，實(shí)踐證明，本研究提供的方法增強(qiáng)了IVD試劑溯源過程的可操作性。

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[3]Medical laboratories.Particular requirements for quality and competence[J].International Standard ISO 15189，2003：1-4.

[4]In Vitro diagnostic medical devices. Directive 98/79/EC of European Parliament and of the Counlil of 27 ctober 1998 on in ritro diagnostic medical devices[S].official Joumal 331,1998-07-12.

[5]ISO/IEC Guide 98.ISO standard A Guide to Expression of Uncertainty in Measurement[S].2008..

[6]楊振華.關(guān)注測(cè)量不確定度在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2007，30（5）：965-966.

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