王鳳林 萬林春 李謹(jǐn)謹(jǐn) 張碩峰

1.武警總醫(yī)院藥劑科，北京 100039；2.江西省食品藥品檢驗(yàn)所，江西 南昌 330029；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100102

膠原蛋白多肽是膠原蛋白經(jīng)蛋白酶酶解后的產(chǎn)物，其生物活性主要體現(xiàn)在提高免疫活性、降血壓、調(diào)血脂、抗氧化、活化細(xì)胞機(jī)能和抑制腫瘤活性等方面[1]。另外，膠原蛋白多肽還具有改善皮膚的功效。津田友香等從魚皮中得到水解膠原三肽，并證明具有促進(jìn)人皮膚成纖維細(xì)胞膠原和透明質(zhì)酸的生成、改善皮膚彈性的作用[2]。Koyama等[3]發(fā)現(xiàn)膠原蛋白多肽能提高皮膚真皮和表皮的功能。在美國、德國、日本等國家，許多高檔化妝品中添加有膠原蛋白。美國CTFA化妝品原料手冊(cè)錄用的天然物質(zhì)和《功能性化妝品原料》中，都有膠原蛋白或其水解產(chǎn)物[4-5]。文獻(xiàn)報(bào)道中多為各種魚鱗膠原蛋白的免疫增強(qiáng)作用。因此，本實(shí)驗(yàn)以小鼠為研究對(duì)象，探討暹羅鱷魚鱗膠原蛋白多肽對(duì)正常小鼠免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魚鱗膠原蛋白肽：購自山東省青州隆貝生物科技有限公司，暹羅鱷魚鱗膠原蛋白多肽[魯衛(wèi)食證字（2008）第370781-005179號(hào)）]：鱷魚皮購自養(yǎng)殖場，膠原蛋白自制；制法：用熱水燙鱷魚皮，使魚鱗自皮上脫落，得到的魚鱗剪成小塊，加0.05 mol/L NaOH溶液（W∶V＝l∶6）浸泡1 h，水洗至中性。再加0.2%硫酸溶液（W∶V＝l∶6）浸泡1 h，水洗至中性，最后用熱水抽提過夜，4000 r/min離心20 min，棄去沉淀不溶物，得到粗膠制品，濃縮后，45℃低溫蒸干。稱取制備的膠原蛋白，用100 mL pH 9.0的緩沖液（0.02 mol/L）溶解制成l%的膠原溶液。加中性蛋白酶（酶與底物比為l∶20）并在45℃水浴中水解5 h后，15 min沸水浴中滅活酶，離心（4000 r/min）15 min。用超濾膜對(duì)上清液進(jìn)行超濾處理，得到多肽，于冷凍干燥機(jī)中凍干，備用；清潔級(jí)BALB/C小鼠，18～22 g，購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SCXK《京》2006-0009；刀豆蛋白A（ConA）購自 Sigma公司；MTT、Hanks液（pH 7.2～7.4）、RPMI1640完全培養(yǎng)液、碘硝基氯化四氮唑（INT）、吩嗪二甲酯硫酸鹽（PMS）、環(huán)磷酰胺（CTX）、臺(tái)盼蘭等。

1.2 方法

1.2.1 分組與給藥 將BALB/c小鼠，每組10只隨機(jī)分為6個(gè)組：對(duì)照組、模型組、魚鱗膠原蛋白多肽400 mg/kg組、暹羅鱷魚鱗膠原蛋白多肽200、400、800 mg/kg組。造模同時(shí)開始灌胃給藥，每天1次，連續(xù)15 d。對(duì)照組給予飲用水0.2 mL/10 g體重。

1.2.2 造模方法 除對(duì)照組外，其余各組小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺，0.6 mg/次，每日1次，共3次，對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水0.2 mL/10 g體重。

1.2.3 小鼠脾淋巴細(xì)胞的制備 用750 mL/L酒精浸泡處死后的小鼠，無菌條件下獲取其脾臟。脾臟置于100目網(wǎng)上輕輕碾碎，濾過后加入試管中，離心（1000 r/min）5 min，將細(xì)胞洗滌后棄去上清液，用1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞至4 mL，輕輕鋪于小鼠淋巴細(xì)胞分離液（3 mL，比重 1.088）上，離心（2000 r/min）20 min。吸取單核淋巴細(xì)胞（PBL），1000 r/min離心，計(jì)數(shù)細(xì)胞，用1640（含10% FCS）調(diào)整PBL的密度至5×106/L待用。

1.2.4 ConA誘導(dǎo)小鼠T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) 連續(xù)對(duì)小鼠灌胃15 d，將其頸椎脫臼處死，無菌條件下獲取其脾臟，用鑷子將脾在盛有適量無菌Hanks液的小平皿中輕輕撕碎，200目篩網(wǎng)過濾制成單細(xì)胞懸液，懸液分為2部分，用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)備用。細(xì)胞懸液用Hanks液洗滌2次，每次進(jìn)行10 min（1000 r/min）離心，然后將細(xì)胞懸浮于1 mL的完全培養(yǎng)液中，臺(tái)盼蘭染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)（在95%以上），將細(xì)胞濃度調(diào)整為3×106個(gè)/mL。每份細(xì)胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL，一孔加75μL ConA液作為實(shí)驗(yàn)，另一孔作為對(duì)照，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔吸去上清液0.7 mL，加入0.7 mL不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，同時(shí)加入MTT 50μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入1 mL酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結(jié)晶完全溶解。然后分裝到96孔培養(yǎng)板，每孔做3個(gè)平行孔，用酶標(biāo)儀以570 nm波長測定光密度值。以實(shí)驗(yàn)孔與對(duì)照孔OD的差值代表淋巴細(xì)胞增殖能力。

1.2.5 小鼠NK細(xì)胞殺傷功能實(shí)驗(yàn) 采用LDH釋放法。將小鼠脾細(xì)胞懸液（5×106/L）加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，100μL/孔。將體外傳代培養(yǎng)的YAC-1靶細(xì)胞離心，并調(diào)整細(xì)胞密度為1×108/L，加于 96孔培養(yǎng)板中，100μL/孔（1×104細(xì)胞/孔），置37℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。同時(shí)設(shè)自然釋放和最大釋放組。以1000 r/min離心5 min，吸取上清100μL，加入LDH底物液100μL，靜置30 min顯色。隨后加入0.1 mol/L的HCl終止反應(yīng)，于波長490 nm讀取A值，參照馬安倫等[6]計(jì)算NK細(xì)胞的殺傷率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 膠原蛋白多肽對(duì)淋巴細(xì)胞增殖功能的影響

結(jié)果表明給藥組小鼠T淋巴細(xì)胞的增殖功能較環(huán)磷酰胺組小鼠的功能有明顯上升。特別是鱷魚膠原肽中、高劑量組變化更為明顯（與模型組比較，P＜0.01）。見表1。

表1 鱷魚膠原肽對(duì)環(huán)磷酰胺致免疫功能損傷小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖功能的影響（）

表1 鱷魚膠原肽對(duì)環(huán)磷酰胺致免疫功能損傷小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖功能的影響（）

注：與對(duì)照組比較，△P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.01

組別 劑量（mg/kg）淋巴細(xì)胞增殖能力（OD差值）對(duì)照組 - 10 0.286±0.039模型組 - 10 0.194±0.017鱷魚膠原肽組 200 10 0.375±0.012△400 10 0.439±0.034△*800 10 0.507±0.065△*魚膠原肽組 400 10 0.396±0.045△動(dòng)物數(shù)（%）

2.2 膠原蛋白多肽對(duì)小鼠NK細(xì)胞殺傷活性的影響

不同組別的NK細(xì)胞殺傷結(jié)果顯示，膠原蛋白肽不僅對(duì)環(huán)磷酰胺的免疫抑制效應(yīng)具有拮抗作用，而且具有正向免疫調(diào)節(jié)作用，可提高小鼠的免疫功能，且呈一定的劑量依賴性。不同劑量的膠原蛋白多肽的NK細(xì)胞殺傷活性與環(huán)磷酰胺組相比，也有不同程度的提高。見表2。

表2 鱷魚膠原肽對(duì)環(huán)磷酰胺致免疫功能損傷小鼠NK細(xì)胞殺傷活性的影響（）

表2 鱷魚膠原肽對(duì)環(huán)磷酰胺致免疫功能損傷小鼠NK細(xì)胞殺傷活性的影響（）

注：與對(duì)照組比較，△P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.01

組別 劑量（mg/kg）NK細(xì)胞活性轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)對(duì)照組 - 10 72.81±10.52 0.594±0.078模型組 - 10 60.94±54.15 0.494±0.103鱷魚膠原肽組 200 10 105.43±15.78 0.683±0.178△400 10 181.78±45.73 0.723±0.472△800 10 232.94±19.47 0.846±0.546△*魚膠原肽組 400 10 163.17±63.39 0.717±0.329△動(dòng)物數(shù)（只）NK細(xì)胞活性（%）

3 討論

近年來，鱷魚進(jìn)入我國境內(nèi)，形成一門新的特種動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)，國內(nèi)養(yǎng)殖以暹羅鱷、灣鱷、尼羅鱷為主。國家林業(yè)局在2003年公布可以商業(yè)開發(fā)的54種野生動(dòng)物中，就包括暹羅鱷在內(nèi)的多種鱷魚品種，這些品種都為人工養(yǎng)殖的子二代。隨著鱷魚人工養(yǎng)殖的成功，其價(jià)值得到多方面的開發(fā)，包括旅游觀賞、餐飲、時(shí)裝皮具等。鱷魚皮主要用于制作高檔皮具，魚鱗卻成了工業(yè)垃圾。如何提取、利用魚鱗的膠原蛋白多肽將會(huì)成為水產(chǎn)綜合開發(fā)的新突破。

本研究所先前研究表明，采用環(huán)磷酰胺作為免疫抑制劑處理的小鼠，其T淋巴細(xì)胞增殖功能、NK細(xì)胞的殺傷功能明顯低下。給予小鼠灌胃鱷魚膠原蛋白多肽后，小鼠T淋巴細(xì)胞的增殖功能、NK細(xì)胞的殺傷活性，均具有免疫增強(qiáng)作用（P＜0.05），并呈劑量依賴性。由此可知，暹羅鱷魚鱗膠原蛋白多肽是可以開發(fā)成為增強(qiáng)免疫力保健食品的。

[1]郭瑤，曾名勇，崔文萱.水產(chǎn)膠原蛋白及膠原多肽的研究進(jìn)展[J].水產(chǎn)科學(xué)，2006，25（2）：101-102.

[2]賀玉琢.水解膠原在皮膚的應(yīng)用[J].國外醫(yī)學(xué)（中醫(yī)中藥分冊(cè)），2005，27（4）：246-248.

[3]Koyama Y,Sakashita A,Kuwaba K,et al.Effects of oral ingestionof collagen peptide on the skin[J].Fragrance Journal,2006,34(6):82-85.

[4]張銘讓，林煒.皮膠原蛋在化妝品與蛋白飲料中的應(yīng)用[J].北京皮革，2000，25（10）：42.

[5]裘炳毅.化妝品化學(xué)與工藝技術(shù)大全[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，1997：197.

[6]馬安倫，葛海良，張冬青.抗CD94 mAb與NK細(xì)胞、γδ+T細(xì)胞及CTL功能的關(guān)聯(lián)[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2001，17（2）：164-165.