周 楓

江西中醫(yī)學(xué)院科技學(xué)院藥學(xué)系，江西 南昌 330025

RMP（RPB5-mediating protein）是RNA聚合酶Ⅱ（RNA polymeraseⅡ，RNAP Ⅱ）第5亞基RPB5的調(diào)節(jié)蛋白，其通過與RPB5的特異性結(jié)合來調(diào)節(jié)RNAPⅡ的轉(zhuǎn)錄活性，調(diào)節(jié)多種基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[1-2]。RMP最早于1995年由Cheong等采用Far-Westen印跡法，以32P標(biāo)記的重組人RPB5探針從人肝癌細(xì)胞株的cDNA文庫中篩查得到[3]。目前已有研究表明：RMP是一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，在基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞凋亡、基因組穩(wěn)定以及腫瘤發(fā)生發(fā)展中均可能起重要作用[4]。筆者通過合成RMP基因的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染到肝癌SMMC-7721細(xì)胞中，研究RMP基因?qū)Ω伟┘?xì)胞穩(wěn)定性及遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

SMMC-7721肝癌細(xì)胞株從蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部細(xì)胞生物學(xué)系實(shí)驗(yàn)室購買；G418從Sigma-aldrich公司購買；RT-PCR試劑盒從Fermenant公司購買。RPIM1640培養(yǎng)液和小牛血清從Gibco公司購買。

1.2 方法

將肝癌SMMC-7721細(xì)胞等量分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，分別置于含15%小牛血清的RPIM1640培養(yǎng)液中，將其放入7.5%CO2的培養(yǎng)箱中以37℃恒溫培養(yǎng)24 h。分離出處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。向?qū)嶒?yàn)組中加入2 mL含6μg轉(zhuǎn)染液，在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用G418篩選實(shí)驗(yàn)組中干擾RMP基因的細(xì)胞株。共72 h后，RT-PCR檢測實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組RMP、p21 mRNA的表達(dá)情況。用Bandscan軟件測出兩組細(xì)胞能RMP/GAPDH和p21/GAPDH的灰度值（%）做比較。用體外劃痕法檢測兩組細(xì)胞的遷移能力。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

RT-PCR結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組RMP表達(dá)水平比對(duì)照組明顯下降，實(shí)驗(yàn)組p21mRNA水平也顯著低于對(duì)照組，說明干擾RMP基因降低了p21的表達(dá)，p21對(duì)維持DNA的穩(wěn)定性起重要作用，說明RMP基因有維持細(xì)胞基因穩(wěn)定性的作用。用體外劃痕法比較實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的細(xì)胞遷移能力，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的劃痕寬度高于對(duì)照組，說明實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的遷移能力明顯低于對(duì)照組，RMP基因?qū)Ρ３旨?xì)胞的遷移能力有重要作用。見表1。

3 討論

肝癌是死亡率僅次于胃癌、食道癌的第3大常見惡性腫瘤，目前正嚴(yán)重影響著越來越多的國人的生活質(zhì)量。RMP作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在基因組穩(wěn)定、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、腫瘤發(fā)生發(fā)展中均可能起到重要作用。如何確定RMP基因?qū)Ω伟┘?xì)胞穩(wěn)定性以及遷移能力的影響，成為筆者研究的方向。

表1 兩組RMP/GAPDH與p21 mRNA/GAPDH的灰度值及劃痕寬度比較（）

表1 兩組RMP/GAPDH與p21 mRNA/GAPDH的灰度值及劃痕寬度比較（）

組別 RMP/GAPDH（%）p21mRNA/GAPDH（%） 劃痕寬度（d/μm）實(shí)驗(yàn)組 26.58±2.31 45.78±4.35 208.71±12.43對(duì)照組 39.61±3.17 78.23±3.21 69.61±8.87 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

在本研究中，筆者將合成的小干擾RNA成功轉(zhuǎn)染到SMMC-7721肝癌細(xì)胞中，篩選出穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株作為實(shí)驗(yàn)組。利用RT-PCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞RMP基因表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），而且實(shí)驗(yàn)組p21 mRNA水平也顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），說明RMP基因被干擾以后，能相應(yīng)減弱p21 mRNA的表達(dá)水平，而p21基因?qū)?xì)胞周期調(diào)控有重要作用，那么RMP基因?qū)S持細(xì)胞穩(wěn)定性也能起到一定作用。通過體外劃痕試驗(yàn)，筆者發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的劃痕寬度顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），說明成功干擾RMP基因的細(xì)胞株的遷移能力下降，提示RMP基因在保持細(xì)胞的遷移能力中也有重要作用，其中體外劃痕實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與連曉寧等[4]的研究結(jié)果一致。

綜上所述，筆者認(rèn)為RMP基因與肝癌的發(fā)生、發(fā)展有一定聯(lián)系，并且RMP基因?qū)S持肝癌細(xì)胞的穩(wěn)定性起重要作用，可能是和p21基因協(xié)同調(diào)控肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期，還能保持細(xì)胞的遷移能力，為肝癌的基因治療提供了新的研究方向。

[1]Delgerma L, Hayashi N, Dorjsuren D, et al.Subcellular localization of RPB5-mediating protein and its putative functional partner[J].Mol Cell Biol, 2008,24(19):8556-8566.

[2]Cramer P, Bushnell DA, Fu J, et al.Architecture of RNA polymeraseⅡ and implic- ations for the transcription mechanism[J].Science, 2007, 288(5466):640-649.

[3]Cheong JH, Yi M, Lin Y, et al.Human RPB5, a subunit shared by eukaryotic nuclear RNA polyerases，binds human hepatitis B birus X protein and may play a role in X transactivation[J].EMBO J, 2008, 14(1):143-150.

[4]連曉寧，楊慧翠，曹鍇，等.RMP siRNA對(duì)SMMC-7721肝癌細(xì)胞增殖和遷移能力的影響 [J].腫瘤，2010，30（1）：15-20.