趙 穎 姜文靜 牛膺筠

1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬市立醫(yī)院眼科，山東 青島 266011；2.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬海慈醫(yī)院眼科，山東 青島 266033；3.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院眼科，山東 青島 266003

年齡相關(guān)性黃斑變性是我國主要致盲眼病之一，嚴重危害患者的視力。視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）的氧化損傷是年齡相關(guān)性黃斑變性病程的重要病理機制[1]。近期研究發(fā)現(xiàn)，促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）具有抑制凋亡[2]、抗脂質(zhì)過氧化[3]、神經(jīng)保護[4]等多種生物學(xué)作用。筆者前期報道了EPO對RPE細胞凋亡的抑制作用[5]，本實驗通過建立體外培養(yǎng)的RPE細胞氧化損傷模型，檢測EPO干預(yù)前后RPE細胞活力以及凋亡相關(guān)因子表達的變化，進一步探討其細胞保護機制，為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般材料

EPO、MTT試劑（美國Sigma生物技術(shù)公司）；Caspases-9單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；免疫組織化學(xué)試劑盒（北京中山生物試劑公司）；人RPE細胞(美國細胞培養(yǎng)收集公司，ARPE-19細胞株)；DMEM/F12培養(yǎng)基，新生牛血清，胰蛋白酶，青霉素和鏈霉素（GIBCO生物技術(shù)公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 人RPE細胞的體外培養(yǎng) 詳見文獻[5]。

1.2.2 實驗分組及建立RPE細胞氧化損傷模型 人RPE傳代細胞隨機分為5組，每組4孔：①正常對照組；②過氧化氫氧化損傷模型組（600 μmol/L過氧化氫損傷，不加EPO藥物干預(yù)）；③過氧化氫＋10 IU/mL EPO組（600 μmol/L過氧化氫損傷，10 IU/mL EPO藥物干預(yù)）；④過氧化氫＋20 IU/mL EPO組（600 μmol/L過氧化氫損傷，20 IU/mL EPO藥物干預(yù)）；⑤過氧化氫＋40 IU/mL EPO組（600 μmol/L過氧化氫損傷，40 IU/mL EPO藥物干預(yù)）。

1.2.3 MTT檢測 細胞接種于96孔板，接種密度2×104個/mL，每孔200 μL，每組4孔。培養(yǎng)24 h使細胞融合約80%～90%；將原培養(yǎng)液吸出，按上述分組換入含有不同成份的DMEM/F12培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；更換為正常培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)液，每孔加入MTT終濃度為0.05 mg/mL的無血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)3 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）100 μL，置搖床振蕩10 min，用不含細胞的DMEM/F12培養(yǎng)液調(diào)零，應(yīng)用DG3022型酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長處讀取各孔吸光度（A490）值。

1.2.4 免疫組織化學(xué)法檢測Caspases-9蛋白表達 將RPE細胞按密度2×105個/mL接種于6孔板中，孔內(nèi)預(yù)置4 mm×4 mm的蓋玻片，培養(yǎng)24 h，觀察到細胞融合約80%～90%；將原培養(yǎng)液吸出，按上述分組換入含有不同成份的DMEM/F12培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；更換為正常培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。吸出培養(yǎng)液，0.01 mol/L PBS沖洗3遍，用質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛固定20 min，0.01 mol/L PBS沖洗3遍。取出孔內(nèi)的蓋玻片，細胞面向上置于載玻片上。滴加0.3% H2O2室溫10 min，0.01 mol/L PBS沖洗3遍，復(fù)合消化液室溫10 min，0.01 mol/L PBS沖洗3遍，正常山羊血清室溫10 min，加一抗（鼠抗人Caspases-9單克隆抗體）37℃ 2h，0.01 mol/L PBS沖洗3遍，加二抗37℃ 20 min，SP法染色，DAB顯色，脫水，透明，封片。陽性細胞胞膜和胞質(zhì)呈棕黃色染色?？瞻讓φ眨肞BS代替一抗，其余步驟相同。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 EPO對過氧化氫氧化損傷人RPE細胞活性的影響

MTT法測定各組細胞A490值反映細胞活性變化見表1。氧化損傷組細胞活性顯著降低，與正常組相比較差異有極顯著性（t=11.8692，P＜0.01）。EPO各組的細胞活性均明顯增高，與氧化損傷組比較，10 IU/mL EPO干預(yù)組、20 IU/mL EPO干預(yù)組、40 IU/mL EPO干預(yù)組細胞活性逐漸升高差異均有極顯著性（t值分別為 5.6569、5.7056、9.4299，P＜0.01）。

表1 EPO對過氧化氫損傷人RPE細胞活性的影響

2.2 EPO對過氧化氫損傷人RPE細胞表達Caspase-9的影響

正常組Caspases-9蛋白表達于細胞膜和細胞質(zhì)上，呈少量特異性淺黃色著色。氧化損傷組Caspases-9呈強陽性表達，表現(xiàn)為特異性棕黃色著色。氧化損傷組與正常組比較，表達升高，差異有極顯著性（t=147.5805，P＜0.01）。經(jīng)不同濃度的EPO干預(yù)，Caspase-9的表達不同程度的減弱，在40 IU/mL EPO干預(yù)組減弱的最為明顯。與氧化損傷組比較，10 IU/mL EPO干預(yù)組、20 IUmL EPO干預(yù)組、40 IU/mL EPO干預(yù)組表達逐漸下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t值分別為：18.7409、61.8718、54.9153，P＜0.01）。見表2。

表2 EPO對過氧化氫損傷人RPE Caspases-9蛋白表達的影響（平均光密度值，，n＝4）

表2 EPO對過氧化氫損傷人RPE Caspases-9蛋白表達的影響（平均光密度值，，n＝4）

注：n=4，氧化損傷組和正常組比較，aP＜0.01， EPO組和氧化損傷組比較，bP＜0.01

分組 Caspases-9 t P正常組 3.2±0.2 -過氧化氫氧化損傷組 36.2±0.4a 147.5805 0.000010 IU/mL EPO組 30.2±0.5b 18.7409 0.000020 IU/mL EPO組 18.7±0.4b 61.8718 0.000040 IU/mL EPO組 16.4±0.6b 54.9153 0.0000

3 討論

隨著我國人口老齡化趨勢的加重，年齡相關(guān)性黃斑變性的患病率不斷上升。而研究表明，年齡相關(guān)性黃斑變性的發(fā)病機制與RPE細胞的氧化損傷有關(guān)[6]。RPE細胞吞噬感光細胞外節(jié)會產(chǎn)生過度氧化反應(yīng)，損傷RPE細胞，同時破壞RPE細胞之間構(gòu)成的血－視網(wǎng)膜外屏障，誘發(fā)一系列的病理過程[7]。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，EPO對小鼠視網(wǎng)膜光損傷有治療作用[8]、對RPE細胞氧化損傷有保護作用，可以抑制凋亡、增強超氧化物歧化酶的活性，從而起到抗氧化作用。因此，本研究通過制作人RPE細胞氧化損傷模型，添加不同濃度的EPO進行藥物干預(yù)，進一步研究其保護機制。

本實驗使用MTT法檢測RPE細胞活性。MTT測定是一種有色反應(yīng)，當(dāng)細胞培養(yǎng)液中加入MTT后，能被活細胞攝入，經(jīng)細胞內(nèi)線粒體呼吸鏈酶分解成甲瓚，經(jīng)過分光光度計的檢測細胞活性[9]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)氧化損傷組細胞活性顯著低于正常組，RPE細胞的氧化損傷，破壞了線粒體膜，細胞發(fā)生致死性改變。經(jīng)過EPO藥物干預(yù)的RPE細胞，細胞活性明顯增高，提示不同劑量的EPO均對RPE細胞有保護作用。其中40 IU/mL EPO干預(yù)組的細胞活性最高，與正常組接近，說明40 IU/mL EPO能夠拮抗過氧化氫對RPE細胞的氧化損傷。

本實驗室前期研究已證實EPO對RPE細胞氧化損傷的保護作用通過抑制凋亡來完成。細胞凋亡是指細胞在凋亡基因控制下主動的一種細胞死亡過程[10]。凋亡的發(fā)生由細胞內(nèi)外多種不同的誘因激發(fā)細胞自身凋亡基因的連鎖反應(yīng)而啟動[11]。Caspase-9作為Caspases蛋白酶家族的上游成員，在凋亡的介導(dǎo)中起重要的作用[12]。目前對于RPE細胞凋亡的上游啟動階段尚無明確的研究結(jié)果。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，氧化損傷組Caspases-9蛋白呈陽性表達，較正常組表達升高，顯示在RPE凋亡過程中Caspase-9介導(dǎo)的凋亡途徑起到重要的作用。而外源性EPO干預(yù)可以減少Caspase-9的表達，其抗凋亡機制可能與此有關(guān)。

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