白羽 蔡體久 韓偉 李永峰 劉海亮

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

由于溫室效應(yīng)等環(huán)境問題以及化石能源的日益短缺，世界范圍內(nèi)都在尋求無污染、可再生的替代能源［1］。氫能具有高熱量(122 kJ/g)和無污染等優(yōu)點(diǎn)而被認(rèn)為是未來極具發(fā)展前景的可替代能源［2］。發(fā)酵法生物制氫技術(shù)是一種產(chǎn)生清潔燃料與廢物處理相結(jié)合的新技術(shù)，具有能源回收和廢物處理的雙重功效［3－4］，是解決未來能源問題的重要途徑［5］。提高產(chǎn)氫效率以及降低制氫成本是生物制氫工藝產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的關(guān)鍵。糖蜜是制糖業(yè)的主要副產(chǎn)品之一，其含有豐富的碳水化合物和氮磷物質(zhì)可被微生物所利用，并且糖蜜年產(chǎn)量大(達(dá)到1.6×106kg)［6］，因此發(fā)展以糖蜜為原料的生物制氫產(chǎn)業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景［7］。然而糖蜜的組成極其復(fù)雜，不僅含有對微生物生長有益的成分，同時(shí)存在多種微生物難以利用和轉(zhuǎn)化的成分，并對微生物的生長代謝產(chǎn)生抑制作用［8］。目前在國內(nèi)外報(bào)道的糖蜜生物制氫研究中，多數(shù)以混合菌種為接種物(如活性污泥等)進(jìn)行糖蜜產(chǎn)氫研究［9］，而利用純菌糖蜜發(fā)酵制氫的研究鮮見報(bào)道。李永峰等［10］從以糖蜜為底物的生物制氫反應(yīng)器中分離到產(chǎn)氫新菌Biohydrogenbacterium R3 sp.nov.，屬于目前報(bào)道的產(chǎn)氫菌種產(chǎn)氫能力比較高的菌株之一。本文以高效產(chǎn)氫菌R3為研究對象，以糖蜜廢水為底物，研究連續(xù)流R3菌株糖蜜廢水發(fā)酵產(chǎn)氫能力。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)裝置

試驗(yàn)采用連續(xù)流攪拌槽式反應(yīng)器(CSTR)，為反應(yīng)區(qū)與沉淀區(qū)一體化結(jié)構(gòu)，模型反應(yīng)器總?cè)莘e18.8 L，有效容積9.6 L。反應(yīng)器內(nèi)部有三相分離器，使氣、液、固三相很好地分離，更有利于氣體的傳質(zhì)與釋放。采用計(jì)量泵將原水從進(jìn)水箱泵入反應(yīng)器內(nèi)，通過計(jì)量泵的流量以保證系統(tǒng)進(jìn)水恒定。本試驗(yàn)通過調(diào)節(jié)進(jìn)水流量控制水力停留時(shí)間為6 h。整個(gè)反應(yīng)器采用外纏電熱絲加熱方式，將溫度控制在(35±1)℃，實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)見圖1。

圖1 連續(xù)流生物制氫系統(tǒng)

1.2 菌種來源和厭氧培養(yǎng)方法

產(chǎn)氫新菌Biohydrogenbacterium R3 sp.nov.菌種鑒定的國際DNA數(shù)據(jù)庫登記號為AF363375，從生物制氫活性污泥中分離得到。其透射電鏡照片如圖2所示，R3為革蘭氏陽性菌，不形成芽孢，桿菌;大小為(0.3～0.5)μm×(1.5～2.0)μm;周生鞭毛，且鞭毛較長;形成的菌落呈現(xiàn)白色或乳白色，20～30 d可以長成至直徑為1.0～2.5 mm，菌落邊緣整齊，圓形，光滑，不透明;類脂粒4～6個(gè)，異染粒2～3個(gè);該菌為嚴(yán)格厭氧菌。細(xì)菌培養(yǎng)基的制備和全部實(shí)驗(yàn)操作采用改進(jìn)的Hungate厭氧技術(shù)，以高純氮?dú)鉃闅庀啵?5℃常規(guī)培養(yǎng)。

圖2 菌株R3的透射電鏡照片(20 000×)

1.3 試驗(yàn)廢水

試驗(yàn)廢水采用的是廢糖蜜加水稀釋而成，糖蜜廢水組成成分見表1，配置時(shí)投加一定量的有機(jī)氮磷，使得底物中的m(COD)∶m(N)∶m(P)保持在(200～500)∶5∶1左右，以保證R3菌株在生長過程中對氮、磷的需求。

表1 糖蜜廢水成分

1.4 培養(yǎng)基

基本培養(yǎng)基:葡萄糖20 g·L－1;胰蛋白胨4 g·L－1;牛肉膏2 g·L－1;酵母汁1 g·L－1;NaCl為4 g·L－1;K2HPO4為1.5 g·L－1;L－半胱氨酸0.5 g·L－1;發(fā)酵液10 mL;維生素液(鈷銨素0.01 g·L－1;抗壞血酸0.025 g·L－1;核黃素0.025 g·L－1;檸檬酸0.02 g·L－1;吡多醛0.05 g·L－1;葉酸0.01 g·L－1;對氨基苯甲酸0.01 g·L－1;肌酸0.025 g·L－1)10 mL;微量元素液(MnSO4·7H2O為0.01 g·L－1;ZnSO4·7H2O為0.05 g·L－1;H3BO3為0.01 g·L－1;N(CH2COOH)3為4.5 g·L－1;CaCl2·2H2O為0.01 g·L－1;Na2MoO4為0.01 g·L－1;CoCl2·6H2O為0.2 g·L－1;AlK(SO4)2為0.01 g·L－1)10 mL;刃天青(0.2%)，1～2 mL;pH為6.0～6.4。

1.5 分析方法

發(fā)酵氣體產(chǎn)物及組分采用SC－II型氣相色譜測定。熱導(dǎo)檢測器(TCD)，不銹鋼色譜填充柱長2.0 m;擔(dān)體Porapak Q，50～80目。采用氮?dú)鉃檩d氣，流速為30 mL/min。

液相末端發(fā)酵產(chǎn)物組分及質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用GC－122型氣相色譜測定。氫火焰檢測器，不銹鋼色譜填充柱長2.0 m;擔(dān)體為GDX－103型，60～80目。柱溫、氣化室和檢測室溫度分別為190、220、220℃。氮?dú)庾鳛檩d氣，流速為30 mL/min。

采用國家標(biāo)準(zhǔn)方法測定COD［11］，采用PHS－25型酸度計(jì)測量pH和氧化還原電位(ORP)，采用LML－1型濕式氣體流量計(jì)計(jì)量產(chǎn)氣量。

2 結(jié)果與分析

2.1 底物濃度對產(chǎn)氫能力的影響

產(chǎn)氣(氫)速率是衡量生物制氫反應(yīng)器啟動(dòng)效能的一個(gè)重要指標(biāo)。圖2為底物質(zhì)量濃度與系統(tǒng)產(chǎn)氣和產(chǎn)氫量的變化。從試驗(yàn)結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)進(jìn)水COD質(zhì)量濃度在2 600～4 440 mg/L范圍內(nèi)變化時(shí)，進(jìn)水COD質(zhì)量濃度的變化對純培養(yǎng)R3產(chǎn)氫系統(tǒng)的產(chǎn)氣量和產(chǎn)氫量有明顯的影響，產(chǎn)氣量和產(chǎn)氫量隨著進(jìn)水COD質(zhì)量濃度的下降而降低;然而，當(dāng)進(jìn)水COD質(zhì)量濃度提高時(shí)，產(chǎn)氣量和產(chǎn)氫量也有相應(yīng)的增加。CSTR發(fā)酵產(chǎn)氫系統(tǒng)的最大產(chǎn)氣量和產(chǎn)氫量分別為6.08 L和3 L。

2.2 pH值與COD去除率的變化

在廢水進(jìn)入反應(yīng)系統(tǒng)后，廢水中的物質(zhì)所發(fā)生的一系列生理生化反應(yīng)以及液體的稀釋作用，將迅速改變系統(tǒng)內(nèi)的pH值。如含有大量溶解性碳水化合物(糖、淀粉等)的廢水進(jìn)入反應(yīng)器后，碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生的有機(jī)酸(特別是乙酸)的積累，將使系統(tǒng)內(nèi)pH值下降。pH的變化不僅直接影響參與新陳代謝過程的酶活性，而且不同種類的細(xì)菌在不同pH生境條件下，生長繁殖的速率不同，發(fā)酵代謝產(chǎn)物的種類和數(shù)量也存在差異。圖4為CSTR反應(yīng)器進(jìn)出水pH值與COD去除率的變化情況。在反應(yīng)器運(yùn)行過程中，進(jìn)水pH值的波動(dòng)范圍很大，在3.46～6.45之間，而進(jìn)水pH值與COD去除率呈現(xiàn)相同的變化趨勢，COD去除率在4.69%～35.86%之間波動(dòng)。可見高效產(chǎn)氫菌株R3對進(jìn)水pH值的變化十分敏感，較低的pH值導(dǎo)致微生物的活性下降，正常的生理代謝受到抑制。

圖3 底物質(zhì)量濃度對產(chǎn)氫能力的影響

2.3 氧化還原電位的變化

氧化還原電位(ORP)對微生物生長生理、生化代謝均有明顯影響。生物體細(xì)胞內(nèi)的各種生物化學(xué)反應(yīng)，都是在特定的氧化還原電位范圍內(nèi)發(fā)生的，超出特定的范圍，則反應(yīng)不能發(fā)生，或者改變反應(yīng)途徑。生境中的氧化還原電位可受多種因素影響。它與氧分壓有關(guān)，氧分壓高，氧化還原電位高;氧分壓低，氧化還原電位低。微生物對有機(jī)物的氧化及代謝過程中所產(chǎn)生的氫、硫化氫等還原性物質(zhì)，也會(huì)使環(huán)境中的ORP降低。

圖4 進(jìn)出水pH值與COD去除率的變化情況

在產(chǎn)氫發(fā)酵過程中，較低的氧化還原電位是產(chǎn)氫發(fā)酵微生物生長發(fā)育的必要條件。這是因?yàn)閰捬跷⑸锏纳嬉筝^低的氧化還原電位環(huán)境的原因，使它們的一些脫氫酶系包括輔酶I、鐵氧還蛋白和黃素蛋白等，要求低的氧化還原電位環(huán)境才能保持活性。CSTR反應(yīng)器運(yùn)行過程中ORP的變化情況如圖5所示。ORP基本上保持在較低水平(－445～－420 mV)，有利于連續(xù)流純菌株R3系統(tǒng)高效穩(wěn)定產(chǎn)氫。觀察發(fā)現(xiàn)，ORP與COD去除率存在著一定的線性關(guān)系(見圖6)，y=0.729 5x+339.66(r2=0.657 7)。

圖5 CSTR反應(yīng)器運(yùn)行過程中ORP的變化情況

3 結(jié)論

在系統(tǒng)溫度36℃、水力停留時(shí)間6 h、系統(tǒng)pH值和ORP分別在4.0～4.38和－445～－420 mV等條件下，可以實(shí)現(xiàn)高效產(chǎn)氫菌株R3在CSTR反應(yīng)器中連續(xù)厭氧制氫。

圖6 ORP與COD去除率之間的線性關(guān)系

進(jìn)水底物質(zhì)量濃度的變化對系統(tǒng)的產(chǎn)氫效能的影響十分明顯，進(jìn)水COD在2 600～4 440 mg/L范圍內(nèi)變化，分別得到最大產(chǎn)氣量和產(chǎn)氫量為6.08 L和3 L。進(jìn)水pH值的降低影響系統(tǒng)的COD去除效率，但對出水pH值卻無明顯影響?？梢娺B續(xù)流純培養(yǎng)R3菌株是一個(gè)相對穩(wěn)定的發(fā)酵制氫系統(tǒng)，ORP穩(wěn)定在－445～－420 mV。ORP與COD去除率存在著一定的線性關(guān)系，y=0.729 5x+339.66(r2=0.657 7)。

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