盧東升 王明好 賈 曉

(信陽師范學(xué)院，信陽，464000)

野菊［Dendranthema indicum(L.)Des Moul.］為菊科多年生草本植物，其莖、葉、花均可人藥，有清熱解毒、消炎殺菌、涼血祛腫等功效，能治療疔瘡癤腫、乳腺炎、淋巴結(jié)結(jié)核、胃腸炎、高血壓，亦可防治流感、流行性腦膜炎、肺炎、百日咳等。人們對野菊的藥用成分及其功用已進(jìn)行了系統(tǒng)研究，但關(guān)于野菊內(nèi)生真菌的研究未見報道［1-2］。內(nèi)生真菌對宿主植物生長、發(fā)育、生理代謝均具有重要影響［3］。為了解野菊花內(nèi)生真菌的種類、分布特點(diǎn)，為內(nèi)生真菌有益次生代謝物的研究與利用提供依據(jù)，筆者于2010年7月至9月在豫南地區(qū)選擇了5個樣地，通過標(biāo)樣采集，內(nèi)生真菌的分離與鑒定，對此進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

培養(yǎng)基：馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PSA)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，自然 pH值。倒平板時每100 mL培養(yǎng)基中加入5滴無菌的25%乳酸溶液，以抑制細(xì)菌生長;促孢培養(yǎng)基：KH2PO41 g，KNO31 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KC1 0.5 g，淀粉 0.2 g，葡萄糖 0.2 g，蔗糖 0.2 g，瓊脂 15 g，水1 000 mL，pH值自然;水瓊脂培養(yǎng)基：瓊脂20 g，水1 000 mL，pH值自然。

標(biāo)樣采集：在河南省信陽市選取不同生境條件下的野菊樣地5個(編號分別為 XX、XJH、XS、XHG、NW)。選健康野菊植株，采集沒有腐爛發(fā)霉及病斑、病害的健康新鮮嫩枝、老枝、葉片、花蕾等器官適量，分別裝入無菌紙塑料袋中，存于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

內(nèi)生真菌的分離與鑒定：葉、花蕾內(nèi)生真菌的分離同文獻(xiàn)［4］，莖內(nèi)生真菌分離前，先用自來水將表面沖洗干凈，晾干水分后切成3 cm長的莖段，分別用75%乙醇、2%次氯酸鈉、75%乙醇消毒2、10、1 min，不同消毒劑消毒后均用無菌水沖洗3次，最后將莖段切成0.5 cm短段，老莖縱切成4等份。將莖段接入PSA平板，在28℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，組織塊出現(xiàn)明顯菌落時，依據(jù)菌落形態(tài)特點(diǎn)挑取不同真菌頂端菌絲轉(zhuǎn)接PSA斜面，25℃恒溫培養(yǎng)。將分離純化后的真菌用不同基質(zhì)的培養(yǎng)基誘導(dǎo)產(chǎn)孢，觀察記錄菌落、菌絲、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及孢子形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，參考有關(guān)專著［5-7］進(jìn)行鑒定。

觀測指標(biāo)：統(tǒng)計內(nèi)生真菌在野菊5種植物組織中的定殖率、分離率、多樣性指數(shù)、相似性系數(shù)。計算方法按文獻(xiàn)［8］。

2 結(jié)果與分析

2.1 野菊內(nèi)生真菌的組成與分布

本研究共取野菊組織1 104塊，經(jīng)分離純化得到內(nèi)生真菌948株，其中770株能產(chǎn)生孢子，依據(jù)其形態(tài)特征鑒定為15屬21種，它們絕大多數(shù)屬半知菌，極少數(shù)為子囊菌。另有178株(18.3%)經(jīng)誘導(dǎo)未產(chǎn)生孢子，為非產(chǎn)孢菌株。產(chǎn)孢真菌的分離率及分布見表1，可知，刺盤孢菌(Colletotrichum spp.)、擬莖點(diǎn)霉(Phomopsis spp.)、大莖點(diǎn)霉(Macrophoma sp.)3個屬真菌在各個樣地的野菊各器官均有分布，分離率高達(dá)40.7%～60.4%，是野菊優(yōu)勢內(nèi)生真菌。另外，莖、葉和花器官均有專化的內(nèi)生真菌棲息，說明內(nèi)生真菌分布具有明顯的組織專一性。

2.2 野菊內(nèi)生真菌定殖率

內(nèi)生真菌在各樣地野菊各器官均可定殖，且定殖率較高，總體達(dá)79.2%～99.3%，但不同樣地野菊內(nèi)生真菌定殖率存在明顯差異。按定殖率大小排列依次為：XS(99.3%)＞XX(84.9%)＞NW(83.6%)＞XJH(82.5%)＞XHG(79.2%)。從組織水平上看，內(nèi)生真菌在老枝定殖率最高(95.8%)，其次為葉片(92.0%)，花蕾的定殖率最低(77.8%)。由實驗結(jié)果可知，內(nèi)生真菌在野菊花體內(nèi)的定殖與植物體生存的外部環(huán)境有關(guān)，也與其器官組織結(jié)構(gòu)、生化條件等內(nèi)部微生態(tài)環(huán)境密切相關(guān)。處于陰地濕度較大環(huán)境條件下的野菊花，內(nèi)生真菌定殖率較高，反之，在光照強(qiáng)度大且較干燥的環(huán)境內(nèi)，其內(nèi)生真菌定殖率較低。菊花內(nèi)生真菌的定殖率與器官組織的嫩度成反比，嫩度愈大，定殖率愈低，嫩度越小，定殖率越高。

2.3 野菊內(nèi)生真菌的多樣性與相似性

供試的野菊5個樣地，其內(nèi)生真菌的多樣性指數(shù)不同，從高 到低的順序為XX(2.17)、XJH(1.88)、XS(1.68)、XHG(1.65)、NW(1.46);在供試的 5 種器官中，其內(nèi)生真菌的多樣性指數(shù)較接近，但也有不同，從高到低排列為花蕾(1.48)、葉柄(1.35)、葉片(1.33)、老莖(1.23)、嫩莖(1.13)(表2)。以上數(shù)據(jù)說明野菊花生存外部的環(huán)境對內(nèi)生真菌的多樣性有明顯影響。樣地XX、XJH野菊花均生于林下，生境陰閉且濕度大，為不同真菌在植物體內(nèi)的棲息提供了較好的環(huán)境條件，而樣地NW野菊花生于向陽的山坡雜草叢，生境較干燥，不利于內(nèi)生真菌的定殖。不同樣地之間，野菊花內(nèi)生真菌種類組成的相似性系數(shù)在0.375～0.875范圍內(nèi)，其中樣地XHG與XX之間相似性系數(shù)最高(0.875)，而樣地XS與NW之間相似性系數(shù)最低(0.375);樣地XS、XHG、XJH之間的相似性系數(shù)較高(0.778～0.857)，但樣地 NW 與 XJH、XS、XHG 之間內(nèi)生真菌的相似性系數(shù)較低(0.375～0.462)(表3)。這說明不同樣地野菊生存外部的環(huán)境對內(nèi)生真菌種類組成的相似性系數(shù)也有明顯影響。樣地XS和NW環(huán)境差異較大，一個為向陽山坡而另一個為背陰山坡，它們之間野菊花內(nèi)生真菌的相似數(shù)最低。

表1 野菊內(nèi)生真菌分離率及分布

表2 野菊內(nèi)生真菌定殖率及多樣性指數(shù)

表3 不同樣地野菊內(nèi)生真菌相似系數(shù)

3 討論

研究結(jié)果說明野菊內(nèi)生真菌物種豐富，分布普遍，它們多數(shù)為半知菌，少數(shù)為子囊菌。其中，刺盤孢菌(Colletotrichum spp.)、擬莖點(diǎn)霉(Phomopsis spp.)、大莖點(diǎn)霉(Macrophoma sp.)3個屬真菌分離率高，且分布廣泛，是野菊優(yōu)勢內(nèi)生真菌。內(nèi)生真菌在供試的野菊各器官均有定殖，且定殖率較高，總體達(dá)79.2%～99.3%。環(huán)境條件是影響內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)及真菌多樣性的主要因素，宿主組織類型對內(nèi)生真菌的群落結(jié)構(gòu)也有重要影響。菊科植物內(nèi)生真菌及生態(tài)功能已有研究。曹益鳴等對茅蒼術(shù)內(nèi)生真菌生物多樣性及生態(tài)分布進(jìn)行了研究［9］。茅蒼術(shù)和野菊內(nèi)生真菌比較，二者均具有豐富的內(nèi)生真菌生物多樣性和明顯的組織專一性，但內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異，特別是優(yōu)勢真菌種類完全不同。茅蒼術(shù)內(nèi)生真菌優(yōu)勢種為鐮孢菌(Fusarium sp.)、青霉菌(Penicillium sp.)、絲核菌菌(Rhizoctonia sp.) 和多腔菌菌(Myriangium sp.)，而野菊內(nèi)生真菌優(yōu)勢種為刺盤孢菌(Colletotrichum spp.)、擬莖點(diǎn)霉(Phomopsis spp.)、大莖點(diǎn)霉(Macrophoma sp.)。這說明同一科植物，物種不同其內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)及優(yōu)勢種也不同;宋文玲等對菊花(Chrysanthemum morifolium)內(nèi)生真菌的生態(tài)功能進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌葡萄孢

(Botrytis sp.)和毛殼菌(Chaetomium globosum)與菊花建立共生關(guān)系后，可以提高菊花產(chǎn)量和品質(zhì)［10-11］。野菊內(nèi)生真菌與菊花內(nèi)生真菌的生態(tài)功能是否相同，有待深入研究。另外，據(jù)報道，野菊可以產(chǎn)生黃酮類次級代謝產(chǎn)物，具有抗氧化、抗病毒、抗基因誘變、抑菌消炎等多種藥理作用。野菊花內(nèi)生真菌是否產(chǎn)生具以上功能的黃酮類次級代謝物，需要進(jìn)一步試驗分析。

［1］朱慶書，趙文英.超聲提取野菊花總黃酮及其抑菌活性的研究［J］.化學(xué)與生物工程，2008，25(12)：72-74.

［2］Chang K M，Choi EM，Kimg H.Chemical constituentsof Chrysanthemum indicum L.flower oil and effect on osteoblastic MC3T3-E1 cells［J］.Food Science and Biotechnology，2010，19(3)：815-819.

［3］石瑛.內(nèi)生真菌對植物生長發(fā)育的影響［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2010(6)：36-38.

［4］盧東升，王金平，吳小芹，等.茶樹內(nèi)生真菌的種類及分布［J］.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007(10)：54-80.

［5］魏景超.真菌鑒定手冊［M］.上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1979.

［6］戴芳瀾.真菌的形態(tài)和分類［M］.北京：科學(xué)出版社，1987.

［7］邵力平，沈瑞祥，張素軒.真菌分類學(xué)［M］.北京：中國林業(yè)出版社，1984：1-346.

［8］孫劍秋，郭良棟，臧威，等.藥用植物內(nèi)生真菌多樣性及生態(tài)分布［J］.中國科學(xué) C 輯：生命科學(xué)，2008，38(5)：475-484.

［9］曹益鳴，陶金華，江曙，等.茅蒼術(shù)內(nèi)生真菌生物多樣性與生態(tài)分布研究［J］.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2010，26(2)：137-139.

［10］宋文玲，戴傳超，姜寶娟，等.促進(jìn)菊花苗期生長的內(nèi)生真菌篩選與鑒定研究［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009(1)：149-152.

［11］宋文玲，戴傳超，劉曉珍，等.不同內(nèi)生真菌對菊花產(chǎn)量和品質(zhì)的影響［J］.中藥材，2010，33(1)：4-7.