朱肖菊，王曉杰

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040)

腦血管病是目前嚴重威脅人類健康的疾病之一，占我國居民死亡原因第3位，具有發(fā)病率高、病死率高、致殘率高的特點［1］。伴隨著溶栓療法的運用，再灌注損傷的問題受到越來越多的重視。其中，腦缺血再灌注損傷時的炎癥反應(yīng)可以促進腦梗死的繼發(fā)性腦損害［2］。治療和預(yù)防缺血性中風(fēng)并降低其發(fā)病率和致殘率，已成為亟待解決的問題。

本研究通過原位雜交技術(shù)和免疫組化方法對缺血再灌注大鼠不同時點的細胞間黏附分子－1(ICAM－1)蛋白及其mRNA表達的檢測，旨在對電項針療法在治療急性腦缺血再灌注損傷時的神經(jīng)保護作用的機制進行進一步探討。

1 材料與方法

1．1 材料

成年健康雄性 Wistar大鼠，體重280～320 g。ICAM－1免疫組化試劑盒、ICAM－1原位雜交試劑盒均由武漢博士德生物工程有限公司提供;DAB顯色試劑盒由北京中杉金橋生物公司提供。

1．2 方法

1．2．1 分組

實驗大鼠共96只，隨機分成4組:(A組)假手術(shù)組、(B組)模型組、(C組)電體針組、(D組)電項針組，每組各24只，又隨機將每組大鼠分成12 h、1 d、3 d、5 d共4個時點，平均每個時點各6只鼠。

1．2．2 模型制備

用直徑約0.25 mm的單尼龍縫合線60 mm制作線栓，將一端加熱熔化成光球狀。大鼠術(shù)前禁食12 h。參照Zea－longa方法［3］，先將大鼠進行麻醉后，使其仰臥，碘伏進行頸部皮膚消毒并將毛發(fā)減去。在自胸骨角開始直至距離大鼠下唇1 cm處做一正中切口。暴露頸右側(cè)和前部肌群，暴露大腦中動脈并找到其分叉處，此時可見頸外和頸內(nèi)動脈。結(jié)扎頸外動脈的下部，將兩根絲線穿置于大腦中動脈近心端下部備用。為防止在結(jié)扎大腦中動脈時迷走神經(jīng)受到損傷，此時應(yīng)注意迷走神經(jīng)和大腦中動脈的分離。用血管夾在近大腦中動脈的分叉處將此動脈夾緊。在距離大腦中動脈的分叉處大約1 cm的血管壁上剪一個小切口，將線栓插入切口，結(jié)扎大腦中動脈切口遠心端的絲線，再將血管夾松開后繼續(xù)插送線栓。當(dāng)線栓位于距離大腦中動脈分叉處大約1.8～2 cm處，手下有阻力感時則停止插入。成功插入線栓后，將皮膚縫合，栓線尾端暴露于皮外。假手術(shù)組大鼠只分離頸內(nèi)動脈，不結(jié)扎插線。大鼠腦缺血2 h后輕度將線栓向外拉直至遇到阻力時則停止，將露于皮膚外面的栓線剪去，制作模型手術(shù)結(jié)束。

術(shù)后2 h若大鼠出現(xiàn)以下體征和癥狀則表示模型制作成功:提尾懸空觀察大鼠時，則可出現(xiàn)病灶對側(cè)的前肢呈抬高、屈曲姿勢，肘關(guān)節(jié)呈伸直狀態(tài)、肩內(nèi)收;病灶的同側(cè)可出現(xiàn)眼部霍納氏征，病灶對側(cè)的前爪無法伸展;行走時出現(xiàn)向病灶對側(cè)轉(zhuǎn)圈和傾倒等現(xiàn)象。假手術(shù)組則出現(xiàn)同側(cè)的Horner征，而對側(cè)肢體無癱瘓。

1．2．3 針灸選穴及操作

假手術(shù)組和模型組術(shù)后不進行治療。治療組的大鼠在清醒后立即進行針灸治療。參照《大鼠穴位圖譜》的定位，電體針組取左側(cè)外關(guān)穴、曲池穴、昆侖穴和足三里穴，進針后進行捻轉(zhuǎn)約1 min，連電針。將正極放在上，負極放在下，用一對導(dǎo)線將外關(guān)穴和曲池穴接為一組，昆侖穴和足三里穴連接為另一組，使用疏波，頻率1 Hz，輸出電壓1 V，留針時間30 min，每日1次。電項針組則取雙側(cè)供血穴和風(fēng)池穴。其中，供血穴位于第4頸椎旁開約2 mm處，進針捻轉(zhuǎn)1 min后，連電針，電針操作方法如電體針組。

對4組大鼠在手術(shù)后12 h、1 d、3 d和5 d進行神經(jīng)功能缺損評分后，對其灌注固定取腦。范圍包括從額極至枕極每間隔2 mm平行做5個冠狀切面，取第3和第4腦片并放置在4%多聚甲醛固定液中進行固定。后經(jīng)常規(guī)脫水、透明和石蠟包埋后連續(xù)冠狀切片，以便對腦組織形態(tài)學(xué)進行觀察和對原位雜交及免疫組織化學(xué)的檢測時使用。

1．2．4 檢測觀察方法

采取HE染色的方法對腦缺血再灌注后大鼠的腦組織形態(tài)學(xué)的變化進行觀察;運用原位雜交技術(shù)和免疫組織化學(xué)的方法檢測觀察腦組織ICAM－1蛋白及其mRNA表達的變化。

1．2．5 陽性評定及統(tǒng)計學(xué)分析

光鏡下陽性細胞的特征是細胞內(nèi)或核膜上出現(xiàn)棕黃色斑片或顆粒。染色后在每張切片上于缺血側(cè)基底節(jié)區(qū)和大腦皮層處隨機采集5個高倍視野，進行陽性細胞數(shù)目的檢測并取平均值。數(shù)據(jù)表示用均數(shù)±標準差(±s)，組間比較運用SPSS 13．0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析數(shù)據(jù)。雙側(cè)檢驗則以P＜0.01及P＜0.05說明差別有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

2．1 大鼠腦組織形態(tài)學(xué)的變化

假手術(shù)組:神經(jīng)細胞形態(tài)完整，核仁清晰，各時間點均無梗死灶的出現(xiàn)和炎性細胞的浸潤。模型組大鼠在再灌注3天時可見大部分的神經(jīng)元壞死、崩解;梗死中心邊緣較清楚，壞死徹底。缺血半暗區(qū)神經(jīng)元的密度減小，出現(xiàn)膠質(zhì)細胞和炎性細胞浸潤增多的現(xiàn)象，且細胞周圍之間的間隙呈現(xiàn)增大的趨勢。在腦缺血再灌注5天時，可觀察到有少量的膠質(zhì)細胞在梗死灶的周圍增生的現(xiàn)象。在腦缺血再灌注天3天時，治療組的大鼠出現(xiàn)神經(jīng)細胞的腫脹程度呈現(xiàn)減輕的趨勢，核仁清楚可見，但結(jié)構(gòu)不清楚，并可觀察到有少量的固縮神經(jīng)元。在腦缺血再灌注5天時，在梗死灶的周圍可觀察到有毛細血管少量的增生。此外，電項針組大鼠還可觀察到在梗死灶周圍有粗大的軸突出現(xiàn)，且軸突反應(yīng)和膠質(zhì)細胞增生的情況較電體針組明顯。

2．2 ICAM－1免疫組化結(jié)果

本研究結(jié)果顯示:假手術(shù)組在各時點均無ICAM－1蛋白及其mRNA的陽性信號表達;模型組大鼠在再灌注12 h時，腦缺血區(qū)ICAM－1蛋白開始表達，此時ICAM－1mRNA表達達到高峰，12 h以后表達開始逐漸下降，而ICAM－1蛋白的表達于再灌注1天時達到峰值，以后表達開始逐漸減少。在光鏡下顯示:若觀察到黃褐色毛細血管內(nèi)皮細胞即為陽性表達;ICAM－1蛋白和mRNA的表達數(shù)量于大鼠腦缺血再灌注3天時顯著減少，5天時漸降到腦缺血前的狀態(tài)。治療組在各個時點ICAM－1蛋白和mRNA陽性表達的程度較模型組低，且差異顯著(P＜0.05或P＜0.01)。治療組各個相應(yīng)時點比較差異顯著 (P＜0.05)，電項針組表達的下降程度高于電體針組。見表1、表2。

表1 不同時點各組大鼠ICAM－1表達的陽性細胞數(shù)目(±s)

表1 不同時點各組大鼠ICAM－1表達的陽性細胞數(shù)目(±s)

注:與 B組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0．01;與 C 組比較，△P ＜0．05。

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表2 不同時間點各組大鼠ICAM－1mRNA表達的陽性細胞數(shù)目(±s)

表2 不同時間點各組大鼠ICAM－1mRNA表達的陽性細胞數(shù)目(±s)

注:與B組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與C組比較，△P＜0.05

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3 討論

細胞間黏附分子－1(ICAM－1)是免疫球蛋白超家族成員，廣泛表達在免疫細胞、上皮細胞、神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞和血管內(nèi)皮細胞等多種細胞，參與細胞與細胞間、細胞與基質(zhì)間信號交換，介導(dǎo)細胞黏附、識別、活化、增殖、分化、炎性反應(yīng)發(fā)生、腫瘤轉(zhuǎn)移以及損傷修復(fù)等多種病理生理功能［4］。腦缺血再灌注后由于大量的炎性細胞因子的生成并刺激缺血半暗區(qū)的神經(jīng)元表達粘附分子－1，對白細胞的粘附起促進作用，進而使白細胞的破壞作用得到加強，擴大了梗死面積。因此盡早地抑制ICAM－1的過高表達是極為必要的。

項針療法治療腦部疾病是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)腧穴解剖和傳統(tǒng)的針刺技術(shù)相結(jié)合的一種新方法［5］。目前，有關(guān)項針的實驗室基礎(chǔ)研究正在開展［6～7］。電項針療法是將毫針刺入項部腧穴后，再通以脈沖電流用以頭頸部疾病治療的一種方法，此法簡單、實用性較強并適于推廣。如今，此療法已運用于腦梗死、延髓麻痹、耳鳴、耳聾、共濟失調(diào)、美尼爾氏病等病的治療，并在臨床實踐中取得了明顯的效果。在前人研究的基礎(chǔ)上，本實驗對電項針的作用機制做了進一步的研究，以期為臨床治療提供依據(jù)。

由于椎動脈走行于供血穴和風(fēng)池穴的深部，繼而上升為大腦基底動脈以后，進入大腦Will氏環(huán)而使整個腦組織得到充足的血液供應(yīng)。因此，以腧穴解剖學(xué)的原理為依據(jù)，本實驗選取了這兩個穴位。由于風(fēng)池穴的深層有椎動脈、椎靜脈及枕大、小神經(jīng)的分支分布，淺層有枕小神經(jīng)和枕動、靜脈的分支分布。供血穴的深層分布有椎動脈、椎靜脈和伴行的脊神經(jīng)后支。對供血穴進行針刺可使椎－基底動脈血流速度得到改善，從而改善腦部血液的循環(huán)。

本研究結(jié)果提示:電項針療法可能是通過下調(diào)ICAM－1蛋白和mRNA的表達，使炎性介質(zhì)的釋放受到抑制，從而使再灌注后炎癥反應(yīng)得到減輕。

［1］ 徐虹，洪禮傳，黃艷秋，等．針刺對腦缺血再灌注模型大鼠腦組織基質(zhì)金屬蛋白酶、細胞間黏附分子表達的影響［J］．基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2010，30(7):731 －733

［2］ 聞公靈，婁季宇，白宏英．bFGF對腦缺血再灌注大鼠ICAM－1表達及腦組織含水量的影響［J］．中國實用神經(jīng)疾病雜志，2010，13(17):10－12

［3］ Zea－ longa E，Weinstein PR，Carlson，et al．Reversible middle cerebral arteryocclusion without craniectomy in rat［J］．Stroke，1989，20(1):84－91

［4］ Ostrow sk iRP，Jadhav V，ChenW，et al．Reduced m atr ixme tallopro te inase activ ity and ce ll death a fter g loba l is chem ia in the bra in precond itioned w ith hyperbar ic oxygen［J］．A cta Neuroch irur Suppl，2010，106:47 －49

［5］ 楊續(xù)艷，郭淑穎，王銳，等．電項針療法對大鼠腦缺血再灌注模型HIF－1α 及 HIF－1αmRNA 表達的影響［J］．針灸臨床雜志，2009，25(3):33 －35

［6］ 張曉梅，高維濱．電項針對失眠大鼠促眠作用實驗研究［J］．針灸臨床雜志，2008，24(10):40 －41

［7］ 倪金霞，高維濱，朱文增，等．項針療法對急性腦梗死大鼠病理學(xué)及bcl－2表達的影響［J］．針灸臨床雜志，2007，23(6):46－47