薛永林，任守信，張雁冰，高 玲*

(內(nèi)蒙古大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021)

多維數(shù)據(jù)分析法同時分辨3種熒光光譜重疊的氨基酸

薛永林，任守信，張雁冰，高 玲*

(內(nèi)蒙古大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021)

研究正交信號校正(orthogonal signal correction，OSC)-小波包變換(wavelet packet transform，WPT)-偏最小二乘法(partial least squares，PLS)法用于不經(jīng)化學(xué)分離直接解析熒光光譜嚴(yán)重重疊的色氨酸﹑酪氨酸和苯丙氨酸混合體系。本實(shí)驗(yàn)POSCWPTPLS程序執(zhí)行相關(guān)計算，并將3種化學(xué)計量學(xué)方法(OSC-WPT-PLS、WPT-PLS和PLS)進(jìn)行比較。3種氨基酸的總體相對預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.80%、4.35%和5.14%，結(jié)果表明：OSC-WPT-PLS法優(yōu)于WPT-PLS法和PLS法，將該法用于測定自來水及內(nèi)蒙產(chǎn)的金駱駝酒和河套老窖酒中的色氨酸﹑酪氨酸和苯丙氨酸的含量及其回收率分別為96.9%～103.2%、94.1%～105.4%、95.3%～107.8%，取得良好效果。

多維數(shù)據(jù)分析；熒光光度法；同時測定；色氨酸；酪氨酸；苯丙氨酸

化學(xué)計量學(xué)是化學(xué)、數(shù)學(xué)、統(tǒng)計學(xué)與計算機(jī)科學(xué)的接口，在試驗(yàn)設(shè)計、數(shù)據(jù)處理、信號解析、化學(xué)分類決策及預(yù)報方面有著重要的作用。在食品科學(xué)中引入化學(xué)計量學(xué)可以較好消除背景干擾，分辨食品檢測重疊波譜，揭示波譜數(shù)據(jù)中隱含的信息如結(jié)構(gòu)、種類、性狀等[1-7]。

氨基酸是蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位，是動物體合成蛋白質(zhì)的原料來源，也是人體中必不可少的營養(yǎng)成分之一，屬食品、飼料的營養(yǎng)成分，在醫(yī)學(xué)上具有防病治病的作用，也可作為營養(yǎng)型化妝品的有效成分及合成藥物、表面活性劑、其他工業(yè)產(chǎn)品的化工原料。因此，對氨基酸的分析檢測具有重要意義。熒光分析法具有快速、簡便、靈敏度高等特點(diǎn)，在痕量分析中應(yīng)用廣泛[8]。色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸[9-10]是僅有3種具有內(nèi)源熒光的天然氨基酸，但是3者的熒光激發(fā)、發(fā)射光譜均嚴(yán)重重疊，在熒光檢測中易互相干擾，這就為其多組分的同時測定造成了困難。同一樣品中多種共存組分的同時測定是實(shí)際生產(chǎn)、生活中常常面臨的問題，也是分析化學(xué)要解決的熱點(diǎn)問題[11]，因此，化學(xué)計量學(xué)的優(yōu)點(diǎn)脫穎而出，它有利于提高信噪比，增加測量精密度，改善分析選擇性，拓寬應(yīng)用范圍。本實(shí)驗(yàn)將OSC、WPT和PLS方法相結(jié)合建立OSC-WPT-PLS化學(xué)計量學(xué)方法，對熒光光譜嚴(yán)重重疊的色氨酸﹑酪氨酸和苯丙氨酸混合物進(jìn)行同時測定。

1 材料與方法

1.1 材料﹑試劑與儀器

金駱駝酒 內(nèi)蒙古察右前期金駱駝酒業(yè)股份有限公司；河套酒 內(nèi)蒙古巴盟河套酒業(yè)集團(tuán)；L-色氨酸 北京市東環(huán)聯(lián)合化工廠；L-酪氨酸 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；L-苯丙氨酸 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

3種氨基酸用二次蒸餾水分別配成1.27×10-3、1.89 ×10-2、1.40×10-2mol/L儲備液，工作液根據(jù)所需適當(dāng)稀釋制備；緩沖液：NaH2PO4-NaOH，pH7.2；所用其他試劑除注明外均為分析純；所用水為二次蒸餾水。

RF-5301PC 日本Shimadzu儀器公司；pHS-3B型精密pH計 上海雷磁儀器廠；奔騰IV型計算機(jī) 中國聯(lián)想公司。

1.2 方法

1.2.1 OSC-WPT-PLS法原理

該方法把能有效消除熒光光譜矩陣中與濃度無關(guān)的結(jié)構(gòu)噪音的正交信號校正法(orthogonal signal correction，OSC)[12]和能夠靈活實(shí)現(xiàn)域值轉(zhuǎn)換從而消除測量信號噪音的小波包變換法(wavelet packet transform，WPT)[13-16]與能有效提高回歸性能的經(jīng)典偏最小二乘法(partial l east squares，PLS)[17]有機(jī)結(jié)合，建立OSC-WPT-PLS方法[18]。

該法是結(jié)合OSC、WPT和PLS3種方法優(yōu)點(diǎn)構(gòu)成的一種推廣的PLS方法。將由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)構(gòu)筑的訓(xùn)練集矩陣D和預(yù)測集矩陣Du經(jīng)平均中心化后，用OSC方法進(jìn)行數(shù)據(jù)前處理，濾除結(jié)構(gòu)噪音。為確保最佳的校正能力，最佳OSC因子數(shù)需經(jīng)實(shí)驗(yàn)選擇。OSC校正后的數(shù)據(jù)矩陣，經(jīng)快速小波包變換轉(zhuǎn)入小波包域，通過最佳小波包基和除噪閾值的選擇濾除噪音，選擇處理后的小波包系數(shù)經(jīng)小波包逆變化轉(zhuǎn)入原域。為確保小波包前處理能力，最佳小波包函數(shù)和分解水平需經(jīng)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化獲得。原始數(shù)據(jù)經(jīng)OSC和WPT處理后進(jìn)行PLS回歸。本法可同時解決信號校正、數(shù)據(jù)壓縮、消除噪音和共線及回歸等問題。根據(jù)上述原理，編制名為POSCWPTPLS程序，執(zhí)行相關(guān)計算。

1.2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計

以L16(45)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計。加入16份不同濃度的3種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液于25.00mL容量瓶中，再加入3.00mL NaH2PO4-NaOH緩沖液(pH7.2)，然后用二次蒸餾水稀釋至刻度搖勻。用1cm石英比色皿，激發(fā)波長265nm，在260.0～400.0nm波長范圍，以0.2nm波長間隔，狹縫10nm，靈敏度為低的條件下測量其發(fā)射光譜的熒光強(qiáng)度。并以此數(shù)據(jù)構(gòu)筑訓(xùn)練集熒光強(qiáng)度矩陣D。以L9(33)正交表進(jìn)行正交設(shè)計，將9個合成試樣溶液按上述方法建立預(yù)測集矩陣Du。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光光譜

3種化合物的激發(fā)、發(fā)射熒光光譜分別如圖1a、b所示。從圖1可以看出3種化合物的激發(fā)、發(fā)射光譜存在較嚴(yán)重的重疊，這使得用傳統(tǒng)的峰值定量進(jìn)行選擇性分析非常困難。

圖1 3種氨基酸的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜圖Fig.1 Excitation and emission spectra of phenylalanine, tryptophan and tyrosine

2.2 混合物體系熒光波長的選擇

激發(fā)、發(fā)射波長的選擇是多組分混合物熒光分析的一個重要因素。理想的波長范圍，是能夠盡可能大的保證不同組分的靈敏度，同時又要避免光譜干擾，比如瑞利散射的干擾等。從圖1可見，其3個組分熒光激發(fā)、發(fā)射光譜最大熒光強(qiáng)度分別在257/284nm(苯丙氨酸)、275/354nm(色氨酸)、274/304nm(酪氨酸)，3者的最大激發(fā)波長差別較小，而且3種物質(zhì)的斯托克斯位移都不大，所以選擇激發(fā)波長和發(fā)射波長范圍在這個體系中顯得尤為重要。分別在250～290nm之間試驗(yàn)不同的激發(fā)波長，對本體系熒光強(qiáng)度的影響，結(jié)果顯示當(dāng)激發(fā)波長為265nm時，進(jìn)行發(fā)射光譜掃描效果最好。

2.3 不同pH值對熒光強(qiáng)度的影響

酸度是影響熒光強(qiáng)度的重要因素，在pH6.5～10.5范圍內(nèi)進(jìn)行多次試驗(yàn)，如圖3所示，pH值的變化對色氨酸﹑酪氨酸和苯丙氨酸的熒光強(qiáng)度均影響較大。在pH6.5～7.5時，3種氨基酸均具有較強(qiáng)的熒光信號。綜合考慮，最終選取3.0mL、pH7.2 NaH2PO4-NaOH緩沖液來控制體系的酸度。

圖2 溶液酸度對熒光強(qiáng)度的影響Fig.2 Effect of solution acidity on fluorescence intensities of tyrosine, tryptophan and phenylalanine

2.4 OSC-WPT-PLS方法

參數(shù)選擇是本法的關(guān)鍵步驟。本實(shí)驗(yàn)選擇小波函數(shù)、小波分解水平(L)、OSC因子數(shù)和PLS因子數(shù)，分別對這4種參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，結(jié)果見表1、2。以實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)矩陣D和Du作為原始數(shù)據(jù)，并比較所有組分的預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)偏差(standard error of prediction，SEP)和相對預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard error of prediction，RSEP)。不同的小波函數(shù)具有不同的除噪效果，為獲取最佳的除噪效果，進(jìn)行Daubechies 由2～24，Symmlet由4～10和Coiflet由1～5的優(yōu)化試驗(yàn)，當(dāng)選小波函數(shù)Daubechies為4時，所有組分的RSEP最小。小波分解水平L為1～7實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)L=2時所有組分的RSEP最小。同時對OSC因子數(shù)進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果顯示OSC因子數(shù)選為3時RSEP最小。最終實(shí)驗(yàn)選定的最佳參數(shù)為小波函數(shù)Daubechies =4，L=2，OSC因子數(shù)=3和PLS因子數(shù)=3。

表1 小波包分解水平和其他參數(shù)的最佳化Table 1 Optimization of wavelet packet decomposition levels and other parameters

表2 小波函數(shù)的最佳化Table 2 Optimization of wavelet functions

表3 訓(xùn)練集的組成Table 3 Composition of training set

按正交表L16(45)正交設(shè)計，配制16個色氨酸﹑酪氨酸和苯丙氨酸的混合溶液樣品，其濃度組成見表3。在260.0～400.0nm范圍每隔0.2nm測定其熒光強(qiáng)度，以此數(shù)據(jù)構(gòu)筑訓(xùn)練集熒光強(qiáng)度矩陣D，9個合成未知樣以同樣方式測量熒光強(qiáng)度，構(gòu)筑訓(xùn)練集熒光強(qiáng)度矩陣Du。經(jīng)OSC-WPT-PLS方法計算合成樣中色氨酸﹑酪氨酸和苯丙氨酸的濃度和回收率，結(jié)果見表4。所有化合物的SEP和 RSEP分別為0.214mol/L和2.80%，表明本法成功。

表4 合成未知樣的實(shí)際濃度﹑測定濃度及回收率Table 4 Actual concentrations, determined concentrations and recovery rates of tyrosine, tryptophan and phenylalanine in synthetic unknown samples

2.5 OSC-WPT-PLS、WPT-PLS 和 PLS方法的比較

選用一組合成未知樣分別用OSC-WPT-PLS、WPTPLS和PLS 3種方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。3種方法的比較結(jié)果見表5，由表5可見，所有化合物的總體RSEP分別為2.80%、4.35%和5.14%。結(jié)果表明3種方法均成功，且OSC-WPTPLS法的總體相對預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)偏差最小，所以此法優(yōu)于其他兩種方法。

表5 3種方法測定色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸體系的總體預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)偏差和總體相對預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 5 SEP and RSEP of tryptophan, tyrosine and phenylalanine determined by three methods

2.6 線性范圍及檢出限

對3種組分分別測定其線性范圍，結(jié)果表明，色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸分別在0～1.78×10-5、0～3.78×10-5、0～2.52×10-3mol/L范圍內(nèi)，與熒光信號呈良好的線性關(guān)系。對空白溶液進(jìn)行11次平行測定，以空白溶液熒光強(qiáng)度的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差所對應(yīng)的濃度計算方法的檢出限。表6分別為3種氨基酸的線性關(guān)系以及檢出限測定結(jié)果。

表6 線性方程及檢出限Table 6 Linear equations and detection limits of tyrosine, tryptophan and phenylalanine

2.7 精密度

配制色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸濃度分別為5.08× 10-6、7.56×10-6、5.60×10-4mol/L的單一溶液，在相同儀器條件下用本方法進(jìn)行掃描平行測定11次熒光強(qiáng)度，得到色氨酸﹑酪氨酸﹑苯丙氨酸的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.55%、0.73%、1.4%。

2.8 實(shí)際樣品的測定

采用加標(biāo)回收法，考察不同濃度比的色氨酸﹑酪氨酸和苯丙氨酸在實(shí)際樣中的回收率。分別取3.0mL自來水﹑金駱駝酒和河套老窖酒各3份，分別加入3.0mL NaH2PO4-NaOH緩沖液，再加入不同濃度比的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸溶液，用二次蒸餾水稀至刻度，然后以激發(fā)波長為265nm進(jìn)行掃描發(fā)射光譜，用OSCWPT-PLS方法進(jìn)行計算，結(jié)果見表7。

表7 實(shí)際樣品的濃度及回收率Table 7 Actual concentrations, determined concentrations and recovery rates of tyrosine, tryptophan and phenylalanine in real samples

2.9 干擾實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)表明，常見無機(jī)離子Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe3+、Al3+、SO42-、CO32-、PO43-、NO3-、Cl-等和賴氨酸﹑蘇氨酸﹑蛋氨酸﹑組氨酸﹑半胱氨酸都在相對誤差±5%范圍內(nèi)，不影響測定。

3 結(jié) 論

應(yīng)用OSC-WPT-PLS 法對熒光激發(fā)，發(fā)射光譜嚴(yán)重重疊的色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸3組分混合體系進(jìn)行同時測定，并與WPT-PLS 和 PLS 2種方法進(jìn)行比較。3種方法(OSC-WPT-PLS，WPT-PLS 和PLS)的RSEP 分別為2.80%、4.35% 和5.14%。該法用于測定自來水及內(nèi)蒙產(chǎn)的金駱駝酒和河套老窖酒中3種氨基酸含量的測定，其回收率分別為96.9%～103.2%、94.1%～105.4%和95.3%～107.8%。

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Simultaneous Detection of 3 Amino Acids with Overlapped Fluorescent Spectra by Multi-dimensional Data Analysis

XUE Yong-lin，REN Shou-xin，ZHANG Yan-bing，GAO Ling*
(College of Chemistry and Chemical Engineering, Inner Mongolia University, Huhhot 010021, China)

An orthogonal signal correction-wavelet packet transform-partial least squares (OSC-WPT-PLS) method was proposed for simultaneous detection of tryptophan, tyrosine and phenylalanine with overlapped fluorescent spectra. A program (POSCWPTPLS) was designed to execute relevant calculations and three chemometric methods (OSC-WPT-PLS, WPTPLS and PLS) were compared in this study. The relative standard errors of prediction (RSEP) were achieved for all components by using OSC-WPT-PLS, WPT-PLS and PLS were 2.80%, 4.35% and 5.14%, respectively. The OSC-WPT-PLS method revealed the best detection efficiency among three methods, which could be successfully applied to determine the contents of tryptophan, tyrosine and phenylalanine in water, Gold-Camel wine and Hetao wine made in Inner Mongolia with a recovery rate of respectively 96.9%-103.2%, 94.1%-105.4% and 95.3%-107.8%.

multi-dimensional data analysis；fluorespectrophotometry；simultaneous determination；tryptophan；tyrosine；phenylalanine

O657.3

A

1002-6630(2011)16-0290-05

2010-11-19

國家自然科學(xué)基金地區(qū)項(xiàng)目(21067006；0762003)；內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2009MS0209)

薛永林(1982—)，女，碩士研究生，主要從事分析化學(xué)及化學(xué)計量學(xué)研究。E-mail：xuerui7451@163.com

*通信作者：高玲(1957—)，女，高級工程師，主要從事分析化學(xué)及化學(xué)計量學(xué)研究。E-mail：lingyuxi@hotmail.com