邢志恩，王 軍，戴蘊(yùn)青，陳燕卉，陳　敏*

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

SDS-PAGE-薄層掃描聯(lián)用法測定3種不同來源的乳鐵蛋白

邢志恩，王 軍，戴蘊(yùn)青，陳燕卉，陳敏*

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

目的：建立快速、簡便測定鮮牛奶、轉(zhuǎn)基因牛奶和人乳中乳鐵蛋白的方法。方法：在對樣品脫脂和去除酪蛋白時，水洗乳脂、酪蛋白以提高乳鐵蛋白的回收率。通過十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分離乳清蛋白，薄層掃描法定量。對電泳和薄層掃描的條件進(jìn)行優(yōu)化，電泳使用1.0mm×10齒的試樣格、分離膠質(zhì)量濃度12g/mL、分離電壓100V、上樣量5μL、染色3h、脫色2h；薄層掃描采取鋸齒、雙波長、透射的掃描方式，Y步長和擺幅寬分別為0.1mm和8mm。結(jié)果：可以分離不同來源乳中的乳鐵蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白；乳鐵蛋白加標(biāo)回收率分別為104.53%、108.37%，同板精密度RSD值為3.1003%和1.8151%，在100～2000μg/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9988和0.9990。結(jié)論：此方法可以用于3種乳中乳鐵蛋白的測定。

牛乳鐵蛋白；重組人乳鐵蛋白；十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)；薄層掃描

乳鐵蛋白(lactoferrin，LF)是具有鐵結(jié)合能力的糖蛋白，在哺乳動物的黏膜分泌物中被發(fā)現(xiàn)，其中初乳和常乳的含量最高[1]。乳鐵蛋白的分子質(zhì)量在80000u左右，內(nèi)含鐵結(jié)合部位，鐵含量越高，顯現(xiàn)出的紅色越深。這種堿性蛋白的等電點(diǎn)為8.7[2]。一個乳鐵蛋白分子只有一條多肽鏈折疊形成[3]，含有大約690個氨基酸殘基，現(xiàn)有研究證明人、牛、鼠、羊等動物體內(nèi)的乳鐵蛋白具有高度的同源性[4]。人們已發(fā)現(xiàn)乳鐵蛋白的多種生物活性，如廣譜抗菌、抗病毒、抗癌、免疫調(diào)節(jié)[5]、抗氧化[6]等。如今有廠家在乳制品中添加乳鐵蛋白，制成功能食品，如嬰兒配方奶粉、乳鐵蛋白粉、牛初乳粉；也有研究將人乳鐵蛋白的基因成功轉(zhuǎn)入到牛體內(nèi)，牛乳中含有的重組人乳鐵蛋白含量可觀[7]。隨著乳鐵蛋白商業(yè)化的發(fā)展，建立一種快速、簡便、精確、消耗少并可以廣泛運(yùn)用的檢測方法，成為迫切解決的問題。

十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE)是最常用的蛋白分離方法，乳鐵蛋白只有一條肽鏈，在變性電泳上形成一個條帶。將電泳的條帶進(jìn)行薄層掃描(thin layer chromatography scanning，TLCS)，掃描值即條帶的光吸收值，與條帶中的蛋白質(zhì)量濃度呈線性相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)旨在建立一種快速、簡便的乳制品前處理過程，并運(yùn)用SDS-PAGE-薄層掃描聯(lián)用的方法定量檢測乳制品中牛乳鐵蛋白(bovine lactoferrin，bLF)、人乳鐵蛋白(human lac toferrin，hLF)和重組人乳鐵蛋白的含量(recombinant human lactoferrin，rhLF)。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

乳鐵蛋白Ⅰ(即牛乳鐵蛋白，純度95%) 上海貝基生物科技有限公司；乳鐵蛋白Ⅱ(從轉(zhuǎn)基因牛奶中提取)中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；牛α-乳白蛋白(純度85%，)、牛β-乳球蛋白(純度90%) 美國Sigma公司。

鮮牛奶(未經(jīng)處理)；人乳(北京西苑醫(yī)院提供，收集于滿月第8天第38個泌乳日)；轉(zhuǎn)基因牛奶(轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白基因) 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

鹽酸、甲醇、醋酸均為分析純：三羥甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸、十二烷基磺酸鈉(SDS)、丙烯酰胺(Acr)、甲叉雙丙烯酰胺(Bis)、過硫酸銨(AP)、N,N,N', N'-四甲基乙二胺(TEMED)、巰基乙醇、甘油、考馬斯亮藍(lán)G-250、溴酚藍(lán)均為電泳級。

GL-20B高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；PP-15 pH計 德國賽多利斯公司； DYCZ-24電泳槽、DYY-10C電泳儀 北京六一儀器廠；SHZ-88搖床 太倉實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；CS-9301雙波長飛點(diǎn)薄層掃描儀 日本島津公司；WH-2微型旋蝸混合儀 上海滬西分析儀器廠；微量進(jìn)樣器(10μL) 上海高鴿工貿(mào)有限公司。

1.2樣品預(yù)處理

1.2.1轉(zhuǎn)基因牛奶和人乳的預(yù)處理

量取樣品奶液10mL，離心脫脂，取水層；將3mL去離子水加入脂肪層，渦旋3min洗滌其中殘留的乳鐵蛋白，離心，共清洗2次，合并水相。用2mol/mL鹽酸將水相調(diào)節(jié)至pH4.6。室溫靜置40min待酪蛋白沉淀，離心，收集上清液；再用3mL去離子水加入酪蛋白層渦旋3mi n，離心，收集上清液，共清洗2次，合并水相，定容至25mL，4℃保存?zhèn)溆?。上述離心操作均在4℃條件以3000r/min進(jìn)行15min。

1.2.2鮮牛奶的預(yù)處理

量取樣品奶液15mL，清洗脂肪層1次，酪蛋白層2次。其余步驟與1.2.1節(jié)相同。

1.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取20.00mg的乳鐵蛋白Ⅱ(LFⅡ)標(biāo)準(zhǔn)品，用去離子水溶解，定容到10mL(2000μg/mL)，并依次稀釋為1500、1000 、500、100、50μg/mL。用于測定。牛乳鐵蛋白(bLF)標(biāo)液的配制同LFⅡ。

1.4SDS-PAGE條件

電泳之前，取100μL樣品液，加入等體積的樣品緩沖液(2×，10%巰基乙醇，0.04g/mL SDS)，沸水加熱5min，冷卻備用或-20℃貯存；分離膠質(zhì)量濃度12g/mL、濃縮膠質(zhì)量濃度4.5g/mL；恒壓電泳，分離電壓100V，濃縮電壓60V；試樣格1.0mm×10齒；上樣量5μL；染色液：0.1g/mL考馬斯亮藍(lán)G-250、45%甲醇、10%醋酸溶液；脫色液：25%甲醇、10%醋酸溶液。

電泳結(jié)束后，在半徑為6cm的培養(yǎng)皿里，加入100mL去離子水浸泡10min，浸出SDS；加入染色液25mL，搖床80r/min，染色3h；0、1h和1.5h時，各加入脫色液50mL，共脫色2h。

1.5薄層掃描條件

掃描方式：鋸齒，雙波長，透射；Y步長0.1mm；擺幅寬8mm。

雙波長的確立：將光束的斑點(diǎn)移到電泳凝膠的條帶上，進(jìn)行全波長掃描，得到的最大吸收波長，即為樣品波長；同樣，凝膠空白處的最大吸收波長，即參比波長。

2　結(jié)果與分析

2.1樣品前處理?xiàng)l件的選擇

圖1　轉(zhuǎn)基因牛奶乳脂(A)、酪蛋白(B)水洗液的電泳圖Fig.1 SDS-PAGE of aqueous solutions obtained after washing the fat and casein layers from transgenic bovine milk for the first through fourth time

雖然SDS-PAGE對奶液可以直接進(jìn)行蛋白分離，但由于牛奶中高含量的乳脂(3.8%)和酪蛋白(占蛋白總含量的80%)會嚴(yán)重干擾目標(biāo)蛋白的分離效果。被測目標(biāo)乳鐵蛋白是乳清蛋白的成分之一，去除乳脂和酪蛋白后得到乳清，則去掉了電泳分離、薄層掃描檢測中的兩個最大干擾，并省略其他提純?nèi)殍F蛋白的繁瑣步驟，如硫酸銨沉淀[8]、各種層析[9]、超濾[10]等。同時為減小乳脂和酪蛋白分離時目標(biāo)蛋白的損失，水洗脂肪層和酪蛋白層，收集殘留在其中的乳鐵蛋白。取轉(zhuǎn)基因牛奶10mL作為樣品，對脫脂后的脂肪層和酸法沉淀后的酪蛋白層分別水洗4次，收集每次的水洗液用SDS-PAGE電泳監(jiān)測乳鐵蛋白條帶濃度的變化，所得的電泳結(jié)果如圖1所示。

由圖1可見，水洗次數(shù)愈多，目標(biāo)蛋白在水相的含量愈少，因此保證一定的水洗次數(shù)可提高回收率；但水洗次數(shù)增多，合并洗出液后會降低待測樣品液中的蛋白含量，所以需要有足夠的樣品量，否則需對樣品液進(jìn)行濃縮。綜合考慮上述兩個方面，確定對乳鐵蛋白含量較高的轉(zhuǎn)基因牛奶和人乳每次取樣10mL，乳脂和酪蛋白各水洗2次。鮮牛奶中乳鐵蛋白含量相對較少，確定每次取15mL鮮牛奶，對其乳脂水洗1次、酪蛋白水洗2次。乳清定容到25mL待測。

2.2SDS-PAGE條件的選擇

2.2.1試樣格以及凝膠厚度的選擇

試樣格齒的大小會改變電泳條帶的形狀，其厚度與凝膠的厚度對應(yīng)，這些會對蛋白條帶的薄層掃描結(jié)果產(chǎn)生影響。選用同一種處理過的奶液，分別使用1.0mm× 10齒、1.0mm×15齒、1.5mm×10齒的試樣格，薄層掃描3種不同的凝膠條帶，所得結(jié)果如圖2所示。

圖2　梳子類型對樣品薄層掃描的影響Fig.2 Effect of comb type on thin layer chromatography scanning

由圖2可知，從薄層掃描目標(biāo)峰的形狀和分離程度分析，使用1.0mm×10齒(Ch1)的試樣格，目標(biāo)蛋白實(shí)現(xiàn)了基線分離，有利于定量掃描；且1.5mm厚的梳子(Ch3)凝膠脫色時間比1.0mm(Ch1)多出1倍。因此選用1.0mm×10齒的試樣格。

2.2.2進(jìn)樣量

配制2000、100μg/mL的牛乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別上樣10.0、8.0、5.0、3.0μL電泳。所得凝膠條帶如圖3所示。

圖3　牛乳鐵蛋白不同質(zhì)量濃度標(biāo)液不同進(jìn)樣量的電泳圖Fig.3 SDS-PAGE of lactoferrin standard at different injection amounts

由圖3可見，進(jìn)樣量越多，會對蛋白條帶分離產(chǎn)生的影響越大。2000μg/mL的標(biāo)液進(jìn)樣8、10μL時得到的條帶與相鄰的條帶距離相近，影響掃描；而100μg/ mL標(biāo)液進(jìn)樣5μL的電泳條帶仍較清晰。因此，確定進(jìn)樣量為5μL。

2.2.3分離膠和分離電壓的選擇

由于定量的要求，采取分辨率高的不連續(xù)電泳，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)參考李珊珊等[11]的電泳條件，確定12%最為合適?？紤]到電泳過程中，產(chǎn)熱對條帶的非預(yù)期影響，電泳的電壓設(shè)定為恒定[12]。電壓過大，產(chǎn)熱加強(qiáng)；過小，時間延長，條帶擴(kuò)散明顯，結(jié)合電泳槽和電泳儀的要求，確定分離電壓為100V。

2.2.4染色脫色時間

考慮經(jīng)濟(jì)、簡便的目的，采用傳統(tǒng)的考馬斯亮藍(lán)G-250染色方法。染色時間保持在3h，會比較充分；雖然有通過加熱的快速染色方法[13]，但加熱對凝膠及條帶有不可把握的影響，故采取常溫?fù)u床染色的方式。為減少脫色時間、實(shí)現(xiàn)條帶有效分離，并使凝膠的背景干擾少，實(shí)驗(yàn)對染色3h的凝膠，分別脫色2、2.5、3.0、12h(0、1、1.5h時各換一次脫色液)。所得條帶的薄層掃描結(jié)果由圖4顯示，4種脫色條件下，蛋白條帶都較清晰，樣品分離較好。但增加脫色時間，效果不明顯。因此確定脫色時間為2h。

圖4　脫色時間對凝膠條帶薄層掃描的影響Fig.4 Effect of gel destaining time on thin layer chromatography scanning

2.3標(biāo)品和樣品的SDS-PAGE電泳分離結(jié)果

牛乳鐵蛋白(bLF)、乳鐵蛋白Ⅱ(LFⅡ)、α-乳白蛋白(α-La)、β-乳球蛋白(β-Lg)的標(biāo)樣，鮮牛奶(加標(biāo))、轉(zhuǎn)基因牛奶和人乳處理后乳清的SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖5所示。

圖5　標(biāo)品和樣品的SDS-PAGE凝膠圖Fig.5 SDS-PAGE of LF standards and milks

由圖5可見，Ch1、Ch4、Ch5、Ch7的電泳條帶清晰，與報道中的分子質(zhì)量相符。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的遷移率，Ch2、Ch3、Ch6奶液通過本電泳條件都能有效分離LF、α-La、β-Lg三種主要成分。人乳中不含β-Lg[14]，這也從Ch3的結(jié)果得到證實(shí)。轉(zhuǎn)基因牛成功分泌了重組人乳鐵蛋白；而普通牛常乳中，只含有微量的LF。

由于人乳、牛奶和轉(zhuǎn)基因牛奶中乳鐵蛋白的同源性，3種蛋白雖然在分子結(jié)構(gòu)上有區(qū)別[15]，但分子質(zhì)量上差異不大。

2.4薄層掃描條件的優(yōu)化

凝膠本身對光有吸收，故采用雙波長的掃描方式以降低凝膠的干擾。薄層掃描有線性和鋸齒兩種掃描方式。線性掃描是尺寸大于通道的光斑，沿著直線掃描樣品條帶；鋸齒掃描，尺寸小于條帶寬度的光斑，逐點(diǎn)沿條帶方向掃描，形成鋸齒形掃描，每個條帶的數(shù)據(jù)都是多個點(diǎn)掃描結(jié)果的累加值。由兩種掃描方式的結(jié)果(圖6)所得，鋸齒、線性掃描對相鄰兩峰的分離效果相似，實(shí)驗(yàn)選擇靈敏度高的鋸齒掃描方式。

圖6　同一凝膠條帶的線性掃描和鋸齒掃描圖Fig.6 Linear and zigzag thin layer chromatographic profiles of the same gel band

薄層鋸齒掃描的光束斑點(diǎn)掃描精密情況，為Y步長，共有0.2、0.1、0.04、0.02、0.01mm 5種。Y步長越小，掃描越精密，但時間越長；Y步長越大，掃描越粗糙，但時間越短。5種方式對本實(shí)驗(yàn)樣品分離效果相似，兼顧縮短掃描時間和降低基線噪音，確定使用0.1mm的Y步長進(jìn)行掃描。

擺幅寬是光束掃描條帶的半徑，擺幅寬不小于電泳條帶的長度。根據(jù)所選1.0mm×10齒的梳子所得的條帶，選用擺幅寬為8mm的掃描方式。

2.5方法學(xué)考察

2.5.1乳鐵蛋白線性關(guān)系考察

LFⅠ(bLF)和LFⅡ標(biāo)準(zhǔn)品以50～2000μg/mL梯度按照上述方法進(jìn)行電泳展開和薄層掃描。以質(zhì)量濃度對應(yīng)電泳條帶的薄層掃描峰面積進(jìn)行線性相關(guān)，得出結(jié)果見表1。

表1　兩種蛋白標(biāo)液的線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Linear regression equations with correlation coefficients and linear ranges of LFI and LFII standards

2.5.2精密度考察

2.5.2.1同板精密度實(shí)驗(yàn)

精密量取bLF 和LFⅡ標(biāo)準(zhǔn)樣品各5份，分別在同塊凝膠上電泳并薄層掃描，記錄掃描峰面積。所得結(jié)果如表2所示。由此得出，同板展開時本方法精密度良好。

表2　兩種蛋白標(biāo)液的同板精密度Table 2 Intra-plate assay precision RSDs for LFI and LFII

2.5.2.2校正系數(shù)的引入

SDS-PAGE電泳選用10齒的試樣格，即每塊凝膠只能測得10個樣品。實(shí)驗(yàn)證明，同一樣品在不同凝膠板之間上的掃描結(jié)果存在微小差異。為糾正不同凝膠板之間的偏差，引入校正系數(shù)(λ)。選擇一個接近樣品質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，作為隨行標(biāo)樣，在凝膠上同時進(jìn)行電泳。所得條帶的掃描值(S)與標(biāo)準(zhǔn)曲線相同質(zhì)量濃度的掃描值(S0)進(jìn)行比較，得出λ=S0/S，作為此塊凝膠上樣品的校正系數(shù)。通過A=λA0(A0，樣品條帶的掃描值)公式，把A帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，求出對應(yīng)的樣品質(zhì)量濃度。

2.5.3重現(xiàn)性考察

按照1.2.1節(jié)和1.2.2節(jié)方法對3種乳進(jìn)行處理，1.4、1.5節(jié)方法檢測3種樣品中乳鐵蛋白含量，不同時間重復(fù)5次，所得重現(xiàn)性結(jié)果如表3所示。鮮牛奶中乳鐵蛋白使用bLF作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，人乳和轉(zhuǎn)基因牛奶使用LFⅡ作為標(biāo)準(zhǔn)樣品。由表3可見，本方法重現(xiàn)性良好。

表3　重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Repeatability of determination of fresh bovine milk,transgenic bovine milk and human milk

2.5.4方法回收率

分別在鮮牛奶和轉(zhuǎn)基因牛奶中添加不同質(zhì)量的bLF和LFⅡ，檢測出回收率結(jié)果如表4所示?？芍?，bLF的平均加標(biāo)回收率為104.53%，LFⅡ的平均加標(biāo)回收率為108.37%。

表4　bLF和LFⅡ回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Recoveries for LFI in fresh bovine milk and LFII in transgenic bovine milk across three spike levels

3　結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的SDS-PAGE分離、薄層掃描檢測的方法，可以用來定量測定3種不同來源乳鐵蛋白的含量。樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化保證了回收率，SDS-PAGE可以有效分離乳清中的乳鐵蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白。此檢測方法相對簡單，靈敏度高，準(zhǔn)確度、重復(fù)性較好，并且克服了溶劑大量損耗的缺點(diǎn)，便于使用。

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Determination of Lactoferrin from Different Sources by SDS-PAGE Followed by Thin Layer Chromatography Scanning

XING Zhi-en，WANG Jun，DAI Yun-qing，CHEN Yan-hui，CHEN Min*
(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

The aim of this study was to develop a rapid and simple method for the determination of lactoferrin from fresh bovine milk, transgenic bovine milk and human milk. After removing fat by centrifugation and precipitating caseins by adjusting pH, the lactoferrin contents were separated by SDS-PAGE (100 V, 12 g/mL gel, comb∶1.0 × 10 teeth, 5μ L injection, staining for 3 h and destaining for 2 h); and then the target fractions in the gel were examined by thin layer chromatography scanner (transmission, zigzag scan, dual wavelength, swing width∶ 8 mm, delta Y∶ 0.1 mm). The results showed that good separation was achieved for lactoferrin (LF), α-lactalbumin (α-La) and β-lactoglobulin (β-Lg) from three different sources. The recoveries for LFI (LF standard obtained from fresh bovine milk) in fresh bovine milk and LFII (LF standard obtained from transgenic bovine milk) in transgenic bovine milk across three spike levels were 104.53% and 108.37%, respectively. The intra-plate assay precision RSDs for LFI and LFII were 3.1003% and 1.8151%, respectively. The calibration curves of LFI and LFII displayed a good linearity within the range of 100 to 2000μ g/mL, with a correlation coefficient of respectively 0.9988 and 0.9990.

bovine lactoferrin；recombinant human lactoferrin；sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)；thin layer chromatography scanning

TS207.3

A

1002-6630(2011)16-0274-05

2010-10-20

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)(2008ZX08007-001)

邢志恩(1986—)，男，碩士研究生，主要從事乳蛋白研究。E-mail：xingzhien0305@163.com

*通信作者：陳敏(1956—)，女，教授，主要從事天然產(chǎn)物研究。E-mail：minch19@163.com