刁靜靜，曹龍奎,2,*

(1.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

大孔吸附樹脂吸附分離高活性玉米抗氧化肽

刁靜靜1，曹龍奎1,2,*

(1.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

采用大孔吸附樹脂對玉米抗氧化肽進行分離，通過單因素試驗得出XAD-7HP樹脂為最適樹脂，在此基礎(chǔ)上，研究不同pH值條件下的靜態(tài)吸附能力和不同解吸劑的靜態(tài)解吸能力等實驗，確定玉米抗氧化肽吸附分離的基本參數(shù)為pH7.0、解吸劑體積分?jǐn)?shù)70%。通過動態(tài)吸附分離實驗得出，該樹脂可以達到分離純化玉米抗氧化肽的目的，而且分離后的玉米肽的抗氧化活性比原液提高了1倍。

大孔吸附樹脂；玉米抗氧化肽；靜態(tài)吸附；解吸

玉米肽具有降血壓、抗氧化、抗疲勞、醒酒護肝等功效，所以對玉米肽的開發(fā)具有廣泛的應(yīng)用前景，而且隨著科技的發(fā)展，人們健康意識的提高及保健意識的增強，玉米活性肽的藥食同源性將更加顯示出其廣闊的應(yīng)用前景。雖然目前對于玉米肽的各種生物活性研究的比較多，但是對于玉米活性肽的快速、簡便、高效的分離方法還需要進一步的探索。

從研究報道中可以看出肽類的分離純化方法主要應(yīng)用大孔吸附樹脂[1-4]、凝膠過濾色譜[5-6]、離子交換色譜[7-8]、高效液相色譜[9-11]、疏水相互作用色譜[12]、親和色譜及薄層層析[13]等，其中凝膠過濾色譜、高效液相色譜、親和色譜等分離手段雖然精確，但是其造價太高不適于工業(yè)化，大孔吸附樹脂、離子交換層析等分離純化方法還沒有可以達到產(chǎn)業(yè)化得水準(zhǔn)。目前對于肽類的工業(yè)化分離多采用具有分子篩功能的膜分離系統(tǒng)，但是分離膜抗污染能力差，膜通量衰減嚴(yán)重，而且分離過程中對操作參數(shù)的控制隨意性太大。大孔吸附樹脂是一種人工合成的多聚物吸附劑，而且吸附樹脂比其他天然吸附劑具有不可替代的優(yōu)點：孔徑大小、比表面積和極性可以任意選擇，而且有吸附快、解吸率高、吸附量大、再生簡單等優(yōu)點，所以在食品中的應(yīng)用前景廣闊，而且對玉米抗氧化肽的分離使用大孔吸附樹脂的研究尚未見報道，本研究利用大孔吸附樹脂對玉米抗氧化肽的靜態(tài)吸附能力進行研究，從不同型號樹脂的篩選、不同pH值條件下的吸附能力、不同解吸劑的解吸能力等綜合考察吸附樹脂對玉米抗氧化肽的吸附能力，為下一步動態(tài)吸附以及產(chǎn)業(yè)化連續(xù)分離提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設(shè)備

玉米蛋白粉 黑龍江昊天玉米開發(fā)有限公司；Alcalase(液態(tài)，酶比活力160000U/mL) 丹麥Novo公司；大豆卵磷脂、抗壞血酸鈉、2,2-二苯基-1-間三硝基苯基聯(lián)肼(DPPH) 美國Sigma公司；組氨酸、L-酪氨酸 北京索萊寶科技有限公司；氯仿、硫代巴比妥酸(均為分析純) 隆寬醫(yī)藥有限公司；大孔吸附樹脂 滄州寶恩吸附材料科技有限公司。

DK-S24型電熱恒溫水浴鍋 上海森信試驗儀器有限公司；LNK-871型凱式定氮儀 江蘇省宜興市科教儀器研究所；AR2104精密電子天平、DELTA 320型pH計梅特勒-托利多儀器有限公司；可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；單柱色譜分離系統(tǒng) 自行研制。

制備單柱色譜分離系統(tǒng)的分離原理：與液相色譜吸附分離的原理類似，利用某種吸附劑對基質(zhì)吸附性能的差異，通過吸附-洗脫的過程，使性質(zhì)很相近的幾種物質(zhì)達到分離。

圖1 單柱色譜分離系統(tǒng)流程圖Fig.1 Flow chart of a single column chromatographic separation system

1.2 方法

1.2.1 玉米蛋白粉的處理

將原料玉米蛋白粉經(jīng)粉碎機粉碎后過篩，收集過篩后的淡黃色粉末，再以95%乙醇作為浸提劑去掉玉米黃色素，得到酶解底物。

表1 各種大孔樹脂的化學(xué)及物理性質(zhì)Table 1 Chemical and physical properties of three types of macroporous resins used in this study

1.2.2 酶水解試驗

將去掉玉米黃色素的玉米蛋白粉(玉米蛋白含量68.32%)，與適量的水混合，配制成底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的樣品溶液，用1mol/L NaO H溶液調(diào)節(jié)溶液pH9.0，加入1mL/g的堿性蛋白酶(按溶質(zhì)含量計)，50℃水浴振蕩水解，反應(yīng)過程中不斷加入1mol/L NaOH溶液，使pH值保持恒定，記錄耗堿量(mL)，用于計算水解度(degree of hydrolysis，DH)。待水解結(jié)束后調(diào)節(jié)pH值到7.0，并在攪拌條件下迅速升溫至95℃，保持10min使酶滅活[13]。預(yù)實驗已經(jīng)確定抗氧化能力較強的水解液的水解度及水解時間，將抗氧化能力較強的水解液凍干后備用。

1.2.3 靜態(tài)吸附試驗

1.2.3.1 大孔吸附樹脂的處理

取適量大孔吸附樹脂，用95%乙醇浸泡24h，充分溶脹后用蒸餾水洗凈備用[2]。

1.2.3.2 不同樹脂對玉米抗氧化肽的吸附能力及解吸能力

準(zhǔn)確稱取已處理好的各種類型的大孔吸附樹脂10g放入2 5 0 m L三角瓶中，分別加入玉米蛋白水解液50mL，使樹脂完全浸泡，放入25℃的恒溫振蕩器中振蕩(180r/min)，吸附一定時間后，過濾，測定吸附前后水解液的體積及多肽含量，以計算吸附量。

將吸附玉米抗氧化肽后的不同型號樹脂用70%乙醇溶液分別處理，方法同吸附能力試驗方法，在同一溫度及轉(zhuǎn)速條件下進行解吸5h，測定解吸量，以此篩選出合適的樹脂進行以下試驗。

1.2.3.3 不同pH值玉米抗氧化肽的靜態(tài)吸附試驗

準(zhǔn)確稱取已確定的大孔吸附樹脂10g放入250mL的三角瓶中，分別加入不同pH值(pH3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)的玉米蛋白水解液50mL，使樹脂完全浸泡，放入25℃的恒溫振蕩器中振蕩(180r/min)，吸附一定時間后，過濾，測定吸附前后水解液的體積及多肽含量，以計算吸附量。

1.2.3.4 靜態(tài)解吸試驗

將處理好的樹脂10g和50mL玉米蛋白水解液一起加入到250mL三角瓶中，置于恒溫振蕩器上振蕩(180r/min)一定時間后，選擇不同的洗脫溶劑對吸附玉米抗氧化肽后的樹脂進行洗脫，洗脫劑分別選用無離子水和10%、30%、50%、70%、95%的乙醇溶液各20mL，在同條件下振蕩，待解吸一定時間后，測定解吸液的體積及蛋白含量。

解吸量/(mg/mL)＝解吸液蛋白質(zhì)量濃度×解吸液體積

1.2.4 大孔吸附樹脂對玉米抗氧化肽的動態(tài)吸附和解吸試驗

將處理過的XAD-7HP樹脂裝入1.0×100cm的層析柱中，在25℃條件下將pH7.0的玉米抗氧化肽溶液上柱，用40%的乙醇溶液作為洗脫劑，用紫外檢測器于215nm波長處檢測流出液的吸光度，收集洗脫峰，干燥備用。

1.2.5 抗氧化能力的測定

參照Saiga等[14]的方法，并略作修改。將動態(tài)解吸后的玉米肽配制成一定濃度，取0.5mL及1×104mol/L DPPH溶液3.5mL加入同一帶塞試管中搖勻，室溫密閉靜置30min，用純?nèi)軇┳鲄⒈?，?17nm波長處測吸光度。根據(jù)下列公式計算每種水解液對DPPH自由基的清除率：

式中：A1為加水解液后DPPH溶液的吸光度；A2為水解液的吸光度；A3為未加水解液時DPPH溶液的吸光度。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值，用Statistix 8.0分析軟件進行統(tǒng)計，平均數(shù)之間顯著性差異(P＜0.05) 通過Turkey HSD進行多重比較分析。并用Sigmaplot 9.0和Excel軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同樹脂對玉米蛋白水解液的吸附能力

由圖2可以看出，在同一條件下，不同型號樹脂對玉米蛋白水解液的吸附能力，其中C型樹脂的吸附能力明顯大于A型和B型樹脂(P＜0.05)。雖然這3種樹脂都屬于中極性樹脂，但是由于其樹脂的孔徑、比表面積和形成氫鍵等因素的不同所得出的結(jié)果也不同，而且直接影響到吸附能力。A型和B型樹脂的比表面積相同，而且平均孔徑大小差異不顯著，因此其吸附能力差異不顯著(P＞0.05)，而C型樹脂的平均孔徑明顯大于A型和B型，因此其吸附能力也明顯大于A和B兩種樹脂。

圖3反映的是A、B、C 3種樹脂在同一溫度下分別采用70%乙醇溶液作為解吸劑條件下的解吸能力，從解吸效率、易于蒸餾回收、節(jié)能、價廉和毒性角度來選擇解吸劑，其中以醇類較佳，所以本實驗采用乙醇作為解吸劑[15]。從圖3可知，C型樹脂的解吸能力明顯強于其他兩種樹脂，差異顯著(P＜0.05)，A型和B型樹脂的解吸能力差異不顯著。這可能是由于：雖然這, 3種樹脂都是針對肽類進行吸附分離的，但是由于前兩種樹脂的結(jié)構(gòu)與C型樹脂的不同，孔徑大小也不同，所以吸附原理不同，因此表現(xiàn)差異比較顯著(P＜0.05)。通過圖2、3得出，C型樹脂的吸附能力和解吸能力都符合試驗需求，選定C型樹脂為最適樹脂。

圖2 不同型號樹脂的吸附能力Fig.2 Effect of resin type on adsorption capacity

圖3 不同型號樹脂的解吸能力Fig.3 Effect of resin type on desorption capacity

2.2 不同pH值的玉米蛋白水解液的靜態(tài)吸附試驗

圖4 不同pH值玉米蛋白水解液的吸附量Fig.4 Effect of pH value on adsorption capacity of XAD-7HP resin

從圖4可以看出，不同pH值的玉米蛋白水解液在同一吸附條件下的吸附量，在同一pH值、25℃條件下采用180r/min進行恒溫振蕩，玉米蛋白水解液的吸附能力都是隨吸附時間的延長而增加，而且在不同pH值條件下的吸附能力不同。從圖4可以看出，pH3.0、6.0、7.0時，其吸附能力要明顯優(yōu)于其他pH值條件下的吸附能力(P＜0.05)，在pH值大于7.0時，玉米蛋白水解液的吸附能力較差，這是由于樹脂具有吸附性與范德華力和氫鍵有關(guān)，又因具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和很高的比表面積而具有篩選性能[16]。C型樹脂能將極性的有機化合物吸附，主要依靠分子中的偶極離子及氫鍵的作用。而且由于是分子吸附，因而解吸也比較容易。由于pH7.0時的吸附能力與pH6.0時的差異不顯著，而且為了下一步在工業(yè)化生產(chǎn)中節(jié)省成本，最終得出pH7.0為最適pH值。

2.3 靜態(tài)解吸試驗

圖5 不同體積分?jǐn)?shù)解吸劑對解吸量的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on desorption capacity of XAD-7HP resin

由圖5可知，在用水作為解吸劑時，隨著解吸時間的延長其解吸量增加，而用10%乙醇溶液進行不同時間解吸時，10、20min和30min之間的解吸量差異不顯著(P＞0.05)，40min與10min相比差異顯著(P＜0.05)。用30%乙醇溶液解吸時，10min的解吸量與其他3個時間的解吸量差異顯著(P＜0.05)，而其他3個樣品間的解吸量差異不顯著(P＞0.05)。在解吸劑為50%或70%的乙醇時，30min的解吸量要高于等體積分?jǐn)?shù)條件下的其他解吸時間的解吸量，而且差異顯著(P＜0.05)，這是由于隨著解吸時間的延長解吸量增加，所以30min的解吸量高于10min和20min的解吸量，而大于40min的解吸量時，可能是由于在較低濃度下，其解吸的速率要低于其吸附的速率，玉米蛋白水解液在此條件下又進行吸附，所以解吸量在40min時有所降低。在用95%乙醇進行解吸時，則隨著解吸時間的延長解吸量增加，這是因為乙醇體積分?jǐn)?shù)太高，一些蛋白和肽類物質(zhì)難于溶解。所以確定70%的乙醇溶液為最佳的解吸劑。

2.4 動態(tài)吸附與解吸試驗

2.4.1 玉米蛋白水解液的動態(tài)吸附與解吸試驗

將30mL 5%的玉米蛋白水解液通過內(nèi)徑為1.0× 100cm的不銹鋼色譜柱，裝柱的XAD-7HP樹脂為100g。用2倍于柱體積的70%乙醇溶液進行解吸，控制流速為4mL/min，分別以2min/管接收流出液(反復(fù)幾次收集)，用紫外檢測器檢測其出峰時間，得到玉米蛋白水解液的解吸曲線，并將收集液冷凍干燥并進行活性測定。

圖6 玉米抗氧化肽的解吸曲線Fig.6 Desorption curve of antioxidant maize peptides from XAD-7HP resin

由圖6可知，10min左右玉米肽就可以被洗脫下來，70min左右被吸附的玉米肽基本解吸干凈；而且在10min左右時，玉米肽在此洗脫流速下解吸曲線上升較快，而在25min后，解吸曲線下降緩慢，洗脫速率減慢，這主要是因為相對分子質(zhì)量較大的組分在70%乙醇溶液中溶解度較低而不容易被解吸下來[17-18]。這說明C型樹脂可以吸附玉米抗氧化肽，而且解吸也比較容易。

2.4.2 XAD-7HP樹脂處理后對玉米抗氧化肽活性的影響

圖7 XAD-7HP樹脂處理對玉米抗氧化肽活性的影響Fig.7 DPPH free radical scavenging rates of maize protein hydrolysate and various elution fractions from XAD-7HP resin

將玉米抗氧化肽解吸時的收集液，每5管合并(即0～10min為1號樣品，10～20min為2號樣品，以此類推)，冷凍干燥后，將其配制成1%的溶液，進行抗氧化活性的測定。從圖7可知，1號樣品的抗氧化活性很低，與其他樣品相比差異顯著(P＜0.05)，結(jié)合圖6可以看出，前10min并沒有玉米肽洗脫下來，從2號樣品開始收集液有一定的活性，而且活性集中在第2、3和4號樣品。第5、6、7號樣品間的抗氧化活性差異不顯著(P＞0.05)。第8號樣品與各個樣品間的差異都比較顯著(P＜0.05)。從圖7可以看出，1%的玉米蛋白水解液具有19%的自由基清除率，等濃度的2號樣品的自由基清除率達到37%，抗氧化活性提高了1倍，3、4號樣品雖然活性也比較強，但是顯著低于2號樣品(P＜0.05)。結(jié)果表明采用XAD-7HP樹脂具有吸附高活性玉米抗氧化肽的能力，而且解吸也比較容易。

3 結(jié) 論

本研究通過對大孔吸附樹脂進行靜態(tài)吸附能力的研究及動態(tài)吸附試驗考證得出以下結(jié)論：通過不同型號樹脂的靜態(tài)吸附和解吸試驗的研究，確定XAD-7HP樹脂為最適吸附樹脂，在此基礎(chǔ)上研究了不同pH值對該樹脂吸附能力的影響，結(jié)果表明pH3.0、6.0、7.0時吸附能力較強，但是由于水解液的pH值為7.0，將此pH值調(diào)節(jié)到3.0或者6.0，都會增加工業(yè)生產(chǎn)中的成本，因此選定最佳pH值為7.0。不同濃度解吸劑的解吸試驗得出，70%的乙醇溶液解吸能力較強。本研究通過動態(tài)吸附試驗來驗證XAD-7HP樹脂吸附能力的結(jié)果表明，該樹脂分離純化玉米抗氧化肽是可行的，而且解吸比較容易。并且在考察樹脂處理后對玉米抗氧化肽活性影響的研究得出，該樹脂可以將高活性的玉米抗氧化肽富集，使其抗氧化活性較原液提高了將近1倍。利用樹脂進行分離純化高活性玉米抗氧化肽具有一定的工業(yè)應(yīng)用前景。

[1]邱雁臨, 胡靜, 繆謹(jǐn)楓, 等. 大孔樹脂分離啤酒酵母中谷胱甘肽的研究[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2008, 24(2)∶ 131-133.

[2]許世芳, 毛麗珍. 大孔吸附樹脂及其在中藥化學(xué)成分純化中的應(yīng)用[J]. 浙江省醫(yī)藥科學(xué)學(xué)報, 2001(6)∶ 45-47.

[3]何炳林, 英文強. 離子交換與吸附樹脂[M]. 上?！?上?？萍冀逃霭嫔? 1995.

[4]趙利, 錢芳, 許建軍, 等. 大孔吸附樹脂及其在蛋白質(zhì)、多肽和氨基酸分離純化中的應(yīng)用[J]. 四川食品與發(fā)酵, 2003, 39(2)∶ 39-41.

[5]LEE S H, SONG K B. Isolation of an angiotensin converting enzyme inhibitory peptide from irradiated bovine blood plasma protein hydrolysates[J]. Journal of Food Science, 2003, 68(8)∶ 2469-2472.

[6]KIM M R, KAWAMURA Y, LEE C H. Isolation and identification of bitter peptides of tryptic hydrolysate of soybean 11S glycinin by reversephase high-performance liquid chromatography[J]. Journal of Food Science, 2003, 68(8)∶ 2416-2422.

[7]ZAE-IK S, RINA Y, SOO-AH P, et al. His-His-Leu, an angiotensin Ⅰconverting enzyme inhibitory peptide derived from korea soybean paste, exerts antihypertensive activity in vivo[J]. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 2001, 49(6)∶ 3004-3009.

[8]WU Jiangping, DING Xiaolin. Characterization of inhibition and stability of soy-protein-derived angiotensin Ⅰ-converting enzyme inhibitory peptides[J]. Food Research International, 2002, 35(4)∶ 367-375.

[9]BLANCA H L, ISIDRA R, MERCEDES R, et al. Preparation of ovine and caprine β-lactoglobulin hydrolysates with ACE-inhibitory activity, Identification of active peptides from caprinen β-lactoglobulin hydrolysed with tbermolysin[J]. International Dairy Journal, 2002(12)∶ 805-812.

[10]MASAFUMI M, NAOYUKI Y, TOSHIAKI T. Identification of an anitihypertensive peptide from casein hvdrolvsate produced by a proteinase from Lactobacillus helveticus CP790[J]. Journal of Dairy Science, 1996, 79(8)∶ 1316-1321.

[11]DANY D, DON E O, SYLVIE F G, et al. Enzyme-induced gelation of extensively hydrolyzed whey proteins by alcalase∶ peptide identification and deternination of enzyme specificity[J]. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 2003, 51(21)∶ 6300-6308.

[12]TAKUO N, LECH O. Purification of glycomacropeptide from nondialyzable fraction of sweet whey by hydrophobic interaction chromatography on phenyl-agarose[J]. Biotechnology Letters, 2000, 22(5)∶ 413-416.

[13]KONG Baohua, XIONG Youli. Antioxidant activity of zein hydrolysates in a liposome system and the possible mode of action[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2006, 54(16)∶ 6059-6068.

[14]SAIGA A, TANABE S, NISHIMURA T. Antioxidant activity of peptides obtained from porcine myofibrillar proteins by protease treatment [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51(12)∶ 3661-3667.

[15]何炳林, 劉永寧. 吸附樹脂AB-8對甜菊甙的吸附性能及在其提取純化中的應(yīng)用[J]. 應(yīng)用化學(xué), 1994, 11(1)∶ 16-19.

[16]劉小平, 李湘南, 徐海星. 中藥分離工程[M]. 北京∶ 化學(xué)工業(yè)出版社, 2005.

[17]宮霞, 趙駿. 大孔吸附樹脂對酪蛋白酶解液的脫鹽作用研究[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(11)∶ 301-303.

[18]潘道東, 林璐. DA201-C大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附ACE抑制肽的研究[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(5)∶ 20-23.

Separation of Antioxidant Peptides from Maize by Macroporous Resin Adsorption

DIAO Jing-jing1，CAO Long-kui1,2,*
(1. Agri-food Processing Development Centre of Heilongjiang, Daqing 163319, China；2. College of Food Science and Technology, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China)

In this study, three types of macroporous resin were assessed for their adsorption and desorption capacity towards antioxidant peptides in the maize protein hydrolysate, prepared by alcalase hydrolysis, and XAD-7HP resin was found to be the most suitable resin among them. The static adsorption of XAD-7HP resin and the static desportion of antioxidant peptides with different desorption solvents were performed under different pH conditions. As a result, the optimal process parameters for the separation of antioxidant peptides were sample pH 7.0 and 70% aqueous ethanol as the desorption solvent. Antioxidant maize peptides were successfully separated by the dynamic adsorption of XAD-7HP resin, resulting in a 2-fold increase in DPPH free radical scavenging activity.

macroporous resin；antioxidant maize peptides；static adsorption；desorption capacity

TQ464.7

A

1002-6630(2011)16-0187-05

2010-11-02

大慶市高新區(qū)創(chuàng)新基金項目(DQGX08YF007)

刁靜靜(1981—)，女，助理研究員，碩士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工與儲藏。E-mail：diaojing--62@163.com

*通信作者：曹龍奎(1965—)，男，教授，博士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工與儲藏。E-mail：longkuicao@yahoo.com.cn