李 超，王乃馨，鄭 義，崔 玨，陳 華

(徐州工程學(xué)院食品工程學(xué)院，江蘇 徐州 221000)

AB-8型大孔吸附樹脂分離純化大葉金花草總黃酮

李 超，王乃馨，鄭 義，崔 玨，陳 華

(徐州工程學(xué)院食品工程學(xué)院，江蘇 徐州 221000)

目的：研究AB-8型大孔吸附樹脂分離純化大葉金花草總黃酮的工藝參數(shù)，為工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。方法：通過靜態(tài)、動(dòng)態(tài)相結(jié)合的方法，確定最佳工藝參數(shù)。結(jié)果：最佳工藝參數(shù)為上樣液pH4.5、上樣液質(zhì)量濃度1.00mg/mL、上樣液流速80mL/h、洗脫液為體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液、洗脫液流速40mL/h、洗脫液用量60mL，分離純化后的總黃酮產(chǎn)品純度可達(dá)66.16%。結(jié)論：采用AB-8型大孔吸附樹脂分離純化大葉金花草總黃酮操作簡(jiǎn)單、安全、成本低廉，有較高的應(yīng)用價(jià)值。

大葉金花草；總黃酮；分離純化

大葉金花草是鱗始蕨科植物烏蕨(Stenoloma chusana (L.) C hing)的全草或根莖，又名野雞尾、金花草、土黃連、中華金粉蕨，具有清熱、解毒、利尿、退黃止血的功效，主產(chǎn)于長(zhǎng)江以南和陜西、四川各地[1-4]。其單方和復(fù)方均具有清熱解毒、利濕、止血的功效。臨床用于治療腸炎、肝炎、咽喉炎等癥，民間用于治療胃癌、腸癌、食物中毒和農(nóng)藥中毒，有“萬能解毒藥”之稱[5]?，F(xiàn)代藥理證明大葉金花草有著明顯的抗菌活性、解毒作用和保肝、抗炎、止血的作用，其主要有效成分是黃酮類化合物[6]。近年來，隨著天然藥物化學(xué)、藥理研究的不斷深入及其分析手段突飛猛進(jìn)，黃酮類化合物在醫(yī)學(xué)上被用于預(yù)防血液類疾病及治療冠狀動(dòng)脈硬化等疾病，它可清除體內(nèi)自由基延緩衰老和抑制腫瘤，防護(hù)紫外線損傷等[7]。大孔吸附樹脂是一類不溶于酸、堿及各種有機(jī)溶劑且有較好吸附性能的有機(jī)高聚物吸附劑，近年來廣泛被應(yīng)用于醫(yī)藥、環(huán)保和食品等領(lǐng)域[8]，在中草藥研究方面也較廣泛，尤其在黃酮類成分中，如紅樹莓總黃酮[9]、銀杏葉總黃酮[10]和杭白菊總黃酮[11]等及其他各類成分均有采用大孔吸附樹脂法進(jìn)行分離純化的研究，應(yīng)用于大葉金花草總黃酮分離純化方面至今未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對(duì)AB-8大孔吸附樹脂純化大葉金花草總黃酮的工藝進(jìn)行研究，為該資源的進(jìn)一步開發(fā)提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大葉金花草購(gòu)自安徽亳州藥材市場(chǎng)，粉碎后過40目篩備用；蘆丁對(duì)照品 中國(guó)藥品生物制品檢定所；AB-8型大孔吸附樹脂 安徽三星樹脂有限公司；其他均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩 浙江上虞華美儀器紗篩廠；風(fēng)選中藥粉碎機(jī) 山東省青州市精誠(chéng)機(jī)械制造有限公司；FA2104N型電子分析天平、7230G型可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；SENCO R201L型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海申生科技有限公司；SBS型數(shù)控記滴自動(dòng)部分收集器 上海滬西分析儀器廠；pHS-3C型酸度計(jì) 上海雷磁儀器廠；LGJ-10型冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 大孔吸附樹脂的預(yù)處理[12]

按文獻(xiàn)[12]方法稍加修改：將準(zhǔn)備裝柱的新樹脂先用適量的乙醇浸泡充分溶脹，然后裝柱，以1 2 0～160mL/h的流速使5～8倍的乙醇通過樹脂層，洗至洗出液加適量的水無白色渾濁現(xiàn)象，再以240～320mL/h的流速使雙蒸水通過樹脂層，洗盡乙醇，最后轉(zhuǎn)入酸堿處理，即用200mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% HCl溶液以160mL/h的流速通過樹脂層，并浸泡3h，而后用雙蒸水以同樣流速洗至出水pH值為中性，再用240mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% NaOH溶液，以200mL/h的流速通過樹脂層，并浸泡3h，而后用雙蒸水以同樣流速洗至出水pH值呈中性。

1.3.2 樣品溶液的制備及測(cè)定

1.3.2.1 樣品溶液的制備

精密稱取大葉金花草樣品3.00g和纖維素酶0.012g于50mL三角瓶中，再加入pH4.5的緩沖溶液30mL，在45℃下酶解2 h，滅酶、離心、抽濾，定容，搖勻。

1.3.2.2 總黃酮含量測(cè)定

以蘆丁為對(duì)照品，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法[13]。精密稱取蘆丁20mg置于250mL容量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，配成質(zhì)量濃度0.08mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，分別置于10mL具塞刻度試管中，先依次分別加體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液5.0、4.0、3.0、2.0、1.0、0mL，再加入0.3mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% NaNO2溶液搖勻后靜止6min，再加入0.3mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% Al(NO3)3溶液搖勻后靜止6min，最后加入4mL 1mol/L NaOH溶液后用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液定容至刻度，搖勻后靜止10min，以體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液為空白參比，于波長(zhǎng)510nm處測(cè)定吸光度。以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，得回歸方程：A=11.688C-0.0301，R2＝0.9990，結(jié)果表明在0.008～0.040mg/mL之間線性良好。

1.3.3 大孔吸附樹脂對(duì)大葉金花草總黃酮吸附容量和吸附率的測(cè)定

分別稱取預(yù)處理好的AB-8型大孔吸附樹脂4.00g于250mL具塞磨口三角瓶中，精密加入30mL質(zhì)量濃度為0.978mg/mL的樣液，避光密封，并置恒溫振蕩器中，在30℃條件下，以120r/min振蕩24h后，過濾，取濾液1mL按1.3.2節(jié)方法在波長(zhǎng)510nm處測(cè)定吸光度(A)，代入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算吸附平衡后溶液中總黃酮質(zhì)量濃度。

式中：R為吸附容量/(mg/g)；C0為吸附液初始質(zhì)量濃度/(mg/mL)；C1為吸附液平衡質(zhì)量濃度/(mg/mL)；V1為吸附液體積/mL；m為樹脂干質(zhì)量/g。

假設(shè)吸附前后吸附液體積不變，可由下式計(jì)算吸附率：

式中：S為吸附率；C0為吸附液初始質(zhì)量濃度/ (mg/mL)；C1為吸附液平衡質(zhì)量濃度/(mg/mL)。

1.3.4 大孔吸附樹脂對(duì)大葉金花草總黃酮洗脫率的測(cè)定

將上述吸附飽和的大孔吸附樹脂用蒸餾水洗至洗脫液無色，濾紙吸干樹脂表面殘留的溶液，準(zhǔn)確加入體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液30mL，置恒溫振蕩器上振蕩24h，過濾，取濾液1mL按1.3.2節(jié)測(cè)定其在波長(zhǎng)510nm處的吸光度(A)，代入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算洗脫液中總黃酮質(zhì)量濃度。

式中：T為洗脫率/%；C0為吸附液初始質(zhì)量濃度/ (mg/mL)；C1為吸附液平衡質(zhì)量濃度/(mg/mL)；C2為洗脫液質(zhì)量濃度/(mg/mL)；V1為吸附液體積/mL；V2為洗脫液體積/mL。

1.3.5 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)特性試驗(yàn)

取大孔吸附樹脂4.00g，裝入250mL具塞磨口三角瓶中，精密加入30mL 0.978mg/mL的樣液，避光密封，并置恒溫振蕩器中，在30℃條件下，以120r/min振蕩24h，每1h各取1mL，測(cè)定其總黃酮質(zhì)量濃度，繪制靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線。

1.3.6 動(dòng)態(tài)吸附洗脫試驗(yàn)

首先將預(yù)處理好的樹脂濕法裝入(1.6cm×20cm)玻璃層析柱中，然后將大葉金花草總黃酮提取液上柱，待樣品溶液全部通過樹脂柱后用去離子水洗至流出液無色，最后洗脫，收集洗脫液。通過測(cè)定總黃酮含量考察各因素對(duì)樹脂性能的影響，確定最佳工藝參數(shù)。

1.3.7 純度的測(cè)定

分別將提取液和洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器回收乙醇后冷凍干燥，得到粉狀產(chǎn)品，再分別準(zhǔn)確稱取總黃酮提取物和純化物粉末0.02g，用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液定容、搖勻、測(cè)定，計(jì)算總黃酮純度。

2 結(jié)果與分析

2.1 靜態(tài)吸附洗脫試驗(yàn)

2.1.1 吸附容量、吸附率及洗脫率

由表1可看出，AB-8大孔吸附樹脂不僅有較大的吸附率，還有較高的洗脫率。

2.1.2 靜態(tài)吸附曲線

圖1 靜態(tài)吸附曲線Fig.1 Static absorption curve of AB-8 maocroporous adsorption resin

從圖1可知，AB-8型大孔吸附樹脂對(duì)大葉金花草總黃酮的吸附為快速平衡型，起始階段的總黃酮質(zhì)量濃度較大，在1h后基本達(dá)到平衡，AB-8型大孔吸附樹脂對(duì)大葉金花草總黃酮具有良好的吸附動(dòng)力學(xué)特性。綜上分析可知，該樹脂對(duì)大葉金花草總黃酮具有良好的吸附洗脫特性，適合大葉金花草總黃酮的分離純化。

2.2 動(dòng)態(tài)吸附洗脫試驗(yàn)

2.2.1 上樣液pH值對(duì)吸附效果的影響

根據(jù)化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)調(diào)整上樣液pH值，可達(dá)到較好的吸附效果。在上樣液質(zhì)量濃度0.77mg/mL和上樣液流速120mL/h條件下，考察不同上樣液pH值對(duì)樹脂吸附效果的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 上樣液pH值對(duì)吸附效果的影響Fig.2 Effect of sample pH on adsorption of AB-8 maocroporous adsorption resin

由圖2可知，從吸附容量考慮，在pH4.5條件進(jìn)行吸附比較合適。這是因?yàn)辄S酮類化合物含多羥基，呈弱酸性，故要達(dá)到較好的吸附效果，吸附需在pH4.5條件進(jìn)行。

2.2.2 上樣液質(zhì)量濃度對(duì)吸附效果的影響

在上樣液pH4.5和上樣液流速120mL/h條件下，考察不同上樣液質(zhì)量濃度對(duì)樹脂吸附效果的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 上樣液質(zhì)量濃度對(duì)吸附效果的影響Fig.3 Effect of sample concentration on adsorption of AB-8 maocroporous adsorption resin

由圖3可知，低質(zhì)量濃度不利于總黃酮的吸附，因?yàn)樯蠘右嘿|(zhì)量濃度偏低，吸附不充分；當(dāng)以1.00mg/mL上柱時(shí)，吸附容量最大，所以選擇上樣液質(zhì)量濃度為1.00mg/mL。

表1 AB-8大孔吸附樹脂對(duì)大葉金花草總黃酮的吸附容量、吸附率及洗脫率Table 1 Adsorption capacity, adsorption rate and elution rate of AB-8 macroporous adsorption resin towards total flavonoids from Stenoloma chusana (L.) Ching

2.2.3 上樣液流速對(duì)吸附效果的影響

在上樣液pH4.5和上樣液質(zhì)量濃度1.00mg/mL的條件下，考察不同上樣液流速對(duì)樹脂吸附效果的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 上樣液流速對(duì)吸附效果的影響Fig.4 Effect of sample loading flow rate of on adsorption of AB-8 maocroporous adsorption resin

由圖4可知，流速為40mL/h時(shí)，滲漏點(diǎn)出現(xiàn)在144mL附近；流速為80mL/h時(shí)，滲漏點(diǎn)出現(xiàn)在118mL附近；流速為120mL/h時(shí)，滲漏點(diǎn)出現(xiàn)在84mL附近；流速為160mL/h時(shí)，滲漏點(diǎn)出現(xiàn)在57mL附近。流速為40mL/h時(shí)，雖然滲漏點(diǎn)出現(xiàn)的最遲，但因?yàn)榱魉俾?，?dǎo)致循環(huán)周期延長(zhǎng)。因此，在此選擇上樣液流速為80mL/h。

2.2.4 動(dòng)態(tài)吸附曲線

將上樣液pH4.5、上樣液質(zhì)量濃度1.00mg/mL和上樣液流速80mL/h的條件下進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，結(jié)果見圖5。

圖5 動(dòng)態(tài)吸附曲線Fig.5 Dynamic adsorption curve of AB-8 maocroporous adsorption resin

由圖5可知，上樣液體積120mL起開始有少量泄漏(此時(shí)吸附容量為17.12mg/g，吸附率為85.19%)，當(dāng)達(dá)到140mL時(shí)樹脂基本不再吸附總黃酮。動(dòng)態(tài)吸附曲線進(jìn)一步說明AB-8型大孔吸附樹脂對(duì)總黃酮有很大的吸附容量，適用于純化大葉金花草總黃酮。

2.2.5 洗脫液體積分?jǐn)?shù)對(duì)洗脫效果的影響

洗脫流速過快，洗脫性能差，洗脫帶寬，而且脫尾嚴(yán)重，洗脫不完全；但是流速過慢，則會(huì)延長(zhǎng)生產(chǎn)周期，通常情況下控制洗脫流速為吸附流速的1/3～1/2，本實(shí)驗(yàn)采用吸附流速的1/2(即40mL/h)進(jìn)行考察[14]。在上樣液pH4.5、上樣液質(zhì)量濃度1.00mg/mL和上樣液流速80mL/h條件下進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，待吸附達(dá)到泄漏點(diǎn)后再分別用體積分?jǐn)?shù)30%、45%、60%、75%、90%的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，結(jié)果見圖6。由圖6可知，體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液的洗脫率最高。

圖6 洗脫液體積分?jǐn)?shù)對(duì)洗脫效果的影響Fig.6 Effect of ethanol concentration on elution rate of AB-8 maocroporous adsorption resin

2.2.6 動(dòng)態(tài)洗脫曲線

圖7 動(dòng)態(tài)洗脫曲線Fig.7 Dynamic elution curve of AB-8 maocroporous adsorption resin

由圖7可知，體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇溶液通過約24mL時(shí)總黃酮開始被洗脫下來，之后在40mL附近時(shí)迅速達(dá)到高峰，通過60mL后，吸附在樹脂上的總黃酮基本被洗脫下來。洗脫曲線出峰快，且無明顯的拖尾現(xiàn)象。

2.3 產(chǎn)品純度測(cè)定

表2 大葉金花草總黃酮的純度Table 2 Purities of total flavonoids from Stenoloma chusana (L.) Ching before and after purification using AB-8 maocroporous adsorption resin

由表2可知，經(jīng)純化后，純度由原來的14.30%提高到了66.16%，提高了3.63倍。

3 結(jié) 論

3.1 AB-8型大孔吸附樹脂為理想的大葉金花草總黃酮分離純化的樹脂，吸附率80.84%，洗脫率79.06%。

3.2 AB-8型大孔吸附樹脂分離純化大葉金花草總黃酮的吸附最佳工藝參數(shù)為上樣液pH4.5、上樣液質(zhì)量濃度1.00mg/mL、上樣液流速80mL/h、洗脫液為體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液、洗脫液流速40mL/h、洗脫液用量60mL。

3.3 在最佳工藝參數(shù)條件下大葉金花草純化產(chǎn)品中總黃酮的純度由14.30%提高到66.16%，提高了3.63倍，由此可以看出AB-8型大孔吸附樹脂可有效地分離純化大葉金花草總黃酮。

[1]張春椿, 熊耀康, 顧芳芳, 等. 烏蕨總黃酮提取工藝研究[J]. 中國(guó)藥業(yè), 2008, 17(2)∶ 42-43.

[2]羅婭君, 肖新峰, 王照麗. 大葉金花草多糖的提取、分離純化及結(jié)構(gòu)分析[J]. 林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè), 2009, 29(1)∶ 68-72.

[3]羅婭君, 肖新峰, 王照麗. 大葉金花草化學(xué)成分的研究[J]. 化學(xué)研究與應(yīng)用, 2009, 21(1)∶ 97-99.

[4]李明芳, 羅婭君, 李輝容. 大葉金花草黃酮類化學(xué)成分的研究[J]. 四川師范大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 32(3)∶ 358-360.

[5]全國(guó)中草藥匯編編寫組. 全國(guó)中草藥匯編∶ 上冊(cè)[M]. 北京∶ 人民衛(wèi)生出版社, 1983∶ 532.

[6]蔡建秀, 黃曉冬. 烏蕨總黃酮及水提液的藥理試驗(yàn)[J]. 福建中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2004, 14(1)∶ 13-14.

[7]胡曉, 楊敬格, 周青. 烏蕨對(duì)樂果的解毒作用[J]. 贛南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 1998, 18(4)∶ 277-279.

[8]朱英, 何遠(yuǎn), 李麗. 大孔樹脂對(duì)地錦草、金銀花葉與杭白菊總黃酮吸附分離性能研究[J]. 醫(yī)學(xué)研究雜志, 2007, 36(1)∶ 56-59.

[9]楊國(guó)偉, 白立敏, 蘇東海, 等. 大孔吸附樹脂純化紅樹莓總黃酮的研究[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2008, 17(2)∶ 147-150; 154.

[10]李月, 陳瑩. 大孔吸附樹脂分離純化銀杏葉總黃酮的研究[J]. 化學(xué)與生物工程, 2009, 26(7)∶ 55-57.

[11]閆克玉, 于靜. 大孔吸附樹脂法純化杭白菊總黃酮[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2008, 24(1)∶ 35-38.

[12]蔡正云, 李莉, 何建國(guó). 槲寄生中黃酮類化合物純化工藝研究[J]. 食品研究與開發(fā), 2009, 30(3)∶ 40-44.

[13]陳健, 姚成. 野馬追中總黃酮的測(cè)定[J]. 南京師范大學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 4 (2)∶ 16-18.

[14]張晴, 陳勇. AB-8大孔吸附樹脂對(duì)紫蘇色素的吸附性能的研究∶pH=3.0時(shí)吸附等溫線和吸附流出曲線的測(cè)定[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 1999, 25(3)∶ 18-21.

Using AB-8 Macroporous Adsorption Resin for Separation and Purification of Total Flavonoids from Stenoloma chusana (L.) Ching

LI Chao，WANG Nai-xin，ZHENG Yi，CUI Jue，CHEN Hua
(College of Food Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221000, China)

Objective∶ To establish optimal parameters for the separation and purification of total flavonoids from the whole plant of Stenoloma chusana (L.) Ching using AB-8 macroporous adsorption resin. Methods∶ Static and dynamic adsorption and desorption behaviors of AB-8 macroporous adsorption resin were evaluated for achieving the best purification of total flavonoids. Results∶ The optimum adsorption and desorption parameters were found to be∶ sample pH 4.5, sample concentration 1.00 mg/mL, sample loading flow rate 80 mL/h, 70% ethanol as the eluent, desorption flow rate 40 mL/h and eluent amount 60 mL, resulting in a total flavonoid purity of 66.16%. Conclusion∶ AB-8 macroporous adsorption resin is safe, economical and easy to use and can therefore be promisingly applied to separate and purify total flavonoids from the whole plant of Stenoloma chusana (L.) Ching.

Stenoloma chusana (L.) Ching；total flavonoids；separation and purification

O623.54；R284.2

A

1002-6630(2011)16-0031-05

2010-10-20

江蘇省高校自然科學(xué)研究面上項(xiàng)目(10KJD360002)；徐州工程學(xué)院培育項(xiàng)目(XKY2010114)

李超(1978—)，男，講師，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)及食品加工。E-mail：chaoge002@163.com