金光春 陳從容 李言君 薛江南 姜 玲 李升鐘 金東春

（1.濱州醫(yī)學(xué)院，山東煙臺(tái)264003；2.韓國(guó)延世大學(xué)，首爾120-752；3.延邊大學(xué)，吉林延吉133000））

目前，異體牙移植作為一種器官移植，因免疫排斥問題未得到解決，至今仍有許多問題有待探索。近年來，隨著器官移植和免疫抑制劑研究的進(jìn)展，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已取得了成功。隨著手術(shù)技巧的成熟和圍手術(shù)期處理等方面的日益完善，異體牙移植已成為多種實(shí)質(zhì)性器官終末期疾病的有效治療手段。盡管各種新的免疫抑制劑不斷問世，但移植后的排斥反應(yīng)仍無(wú)法完全避免[1-3]。如何消除或降低異體牙移植后的免疫排斥反應(yīng)，提高異體牙移植的成功率，是臨床上亟待解決的問題。而且研究報(bào)告不盡相同，尚無(wú)統(tǒng)一的定論[6]。本研究針對(duì)異體牙移植免疫排斥反應(yīng)，探求新的、安全有效的新型免疫抑制劑，為異體牙移植術(shù)在臨床上提供基本資料。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象與實(shí)驗(yàn)組

經(jīng)過血液抗原性確認(rèn)的20只白鼠（4周齡的Sprague-Dawley系）隨機(jī)分為兩組，同種異體移植組和接受組，選擇15只雄性白鼠（30顆上頜左右第1磨牙）為異體牙供者，體重16～20g。選擇15只雌性白鼠（20顆上頜左右第1磨牙）為移植牙受體者，體重16～18g，分成具有相同抗原性和不同抗原性兩類。1組：免疫抑制劑未處理，分別1周、2周、4周、8周時(shí)間段采集實(shí)驗(yàn)標(biāo)本。2組：免疫抑制劑（Tregs）處理，分別1周、2周、4周、8周時(shí)間段采集實(shí)驗(yàn)標(biāo)本。保存溶液采用F medium。靶細(xì)胞采用Sp-20骨髓瘤細(xì)胞。

1.2 生物化學(xué)試劑、反應(yīng)試劑及免疫抑制劑的應(yīng)用

[3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2.5-diphenylte-trazolium bromede，MTT]

溴化二苯四偶氮鹽，兔補(bǔ)體，蛋白水解酶。反應(yīng)試劑是采用10% 二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO/Sigma Chemical Co.，St.Louis，USA）。術(shù)前1天晚和術(shù)前20分鐘依據(jù)實(shí)驗(yàn)分組給予免疫抑制劑1次。

1.3 方法

1.3.1 牙移植術(shù) 采用Ketamine（0.1mL/100gm，Jaeil JaeDang，Korea）藥物麻醉后，用探針進(jìn)行牙周分離，盡量減少對(duì)周圍組織外傷的情況下，用特制的拔牙鉗子拔除異體牙供者的左右上頜第1磨牙，移植于受體者。

1.3.2 效應(yīng)細(xì)胞的制備 無(wú)菌條件下取出同種異體移植組和接受組白鼠脾臟在骨鑿器上磨碎，收集益出的淋巴細(xì)胞，使用60% Pecoll充分的分離淋巴細(xì)胞。

1.3.3 組織學(xué)觀察 1、2、4、8周時(shí)間段進(jìn)行牙移植術(shù)后，處死動(dòng)物，摘除頜骨，10%福爾馬林固定24h，在5%硝酸脫敏溶液中脫敏5d。以牙齒長(zhǎng)軸1mm的間隔垂直切片，制備5μm標(biāo)本，用Hematoxylin-eosin染色并觀察牙根吸收程度及周圍移植區(qū)的免疫排斥反應(yīng)。光鏡下觀察各組標(biāo)本的免疫排斥反應(yīng)的程度。排斥反應(yīng)依據(jù)Muram[7]的分類分為4級(jí)：0級(jí)-無(wú)排斥反應(yīng)；1級(jí)-輕度反應(yīng)；2級(jí)-中度反應(yīng)；3級(jí)-重度反應(yīng)。對(duì)各組各時(shí)間段的病理學(xué)標(biāo)本進(jìn)行分級(jí)分析，觀察各組的免疫抑制效果。

1.3.4 細(xì)胞免疫學(xué)觀察 使用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)檢測(cè)各組受體血清中T淋巴細(xì)胞亞群CD4+和CD8含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)觀察

同種異體移植牙術(shù)后1周開始觀察大多數(shù)牙根吸收及周圍移植區(qū)的免疫排斥反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)牙根周圍引流的免疫細(xì)胞反應(yīng)。在牙根周圍的單核細(xì)胞浸潤(rùn)及局部淋巴結(jié)內(nèi)淋巴母細(xì)胞的產(chǎn)生。移植牙受體區(qū)域纖維血管組織長(zhǎng)入，根尖周圍牙周韌帶細(xì)胞大量破壞，組織血管吸收、壞死，大量的炎細(xì)胞浸潤(rùn)。分布于骨質(zhì)表面，形成骨吸收窩陷。免疫抑制劑未處理的實(shí)驗(yàn)組術(shù)后1周可持續(xù)增加排斥反應(yīng)，植片平均存活時(shí)間為（16.82±2.34）d，4周達(dá)到頂峰。免疫抑制劑處理的實(shí)驗(yàn)組術(shù)后2周開始出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)，至術(shù)后2周達(dá)到頂峰。植片觀察炎細(xì)胞浸潤(rùn)，伴有新生血管長(zhǎng)入牙槽骨周圍，組織切片存活時(shí)間顯著的延長(zhǎng)，為(40.52±1.23)d，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。牙根吸收程度及周圍移植區(qū)的免疫排斥反應(yīng)，見圖1～4。

圖1 1組：1～2周（HE×100）

圖2 2組：1～2周（HE×100）

圖3 1組：4～8周（HE×100）

圖4 2組：4～8周（HE×100）

2.2 免疫排斥反應(yīng)分析

免疫檢測(cè)結(jié)果表明同種異體移植接受組組織切片CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生數(shù)量不如CD4+T細(xì)胞多，其表達(dá)強(qiáng)度明顯高于CD8+T細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞。同種異體移植組未觀察CD8+T細(xì)胞，大部分收集于移植周圍區(qū)域，見表1。術(shù)后4周和8周兩組檢測(cè)值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組不同時(shí)間CD4+T與CD8+T變化（±s，d）

表1 各組不同時(shí)間CD4+T與CD8+T變化（±s，d）

分組 1周 2周 4周 8周1組 86.82±16.27 78.23±9.23 70.88±7.67 32.13±5.39 2組 65.12±23.15 56.05±10.41 59.52±6.55 15.62±4.44

2.3 病理觀察

1組與2組不同時(shí)間段比較，2組病理學(xué)觀察明顯低于1組（P＜0.05），說明抑制劑對(duì)同種異體牙移植術(shù)后排斥反應(yīng)的抑制作用。

表2 各組不同時(shí)間移植排斥反應(yīng)變化

3 討論

異體牙移植面臨的一個(gè)難題是移植后的排斥反應(yīng)。因此，研究異體牙移植免疫排斥反應(yīng)的病理過程及發(fā)病機(jī)制，尋找有效的預(yù)防具有重要意義。

從目前文獻(xiàn)報(bào)道來看，動(dòng)物異體牙移植實(shí)驗(yàn)或臨床異體牙移植病例的成功率約9.6%～83.0%[8-9]。對(duì)于異體牙移植排異反應(yīng)的研究，國(guó)外學(xué)者大多采用非特異性檢測(cè)方法，主要有：（1）宿主對(duì)來自同一供體的“二次皮膚移植”的加速排斥反應(yīng)；（2）受植區(qū)域內(nèi)淋巴結(jié)中免疫淋巴母細(xì)胞的產(chǎn)生。以往的研究認(rèn)為異體牙牙周膜組織所致的移植免疫反應(yīng)是導(dǎo)致牙根吸收、影響移植牙存活率和存活時(shí)間的重要因素[10]。

目前人們常通過選擇和處理異體牙的組織相容性配型試驗(yàn)來消除或降低異體牙移植的免疫排斥反應(yīng)。常用的決定受體組織配型方法是ABO血型相容性試驗(yàn)、HLA分型試驗(yàn)及組織相容性交叉試驗(yàn)。Wang等[11]發(fā)現(xiàn)供受體組織相容性抗原一致的異體牙在移植后1年存活率為85%，而組織相容性抗原不同的異體牙移植后1年存活率只有31%。

免疫抑制劑的使用是抑制同種異體牙移植免疫排斥反應(yīng)，保證移植術(shù)成功的標(biāo)準(zhǔn)之一。尋找較低毒無(wú)害的免疫抑制方法也是目前實(shí)驗(yàn)研究的重點(diǎn)。為有效抑制排斥反應(yīng)，在異體移植后應(yīng)用Tregs的方案，在異體牙移植術(shù)中顯示了良好的效果。Vossen 等[12]用豬同種異體肢體移植模型實(shí)驗(yàn)，確定了免疫抑制方法的可行性，并提出了好的建議。為研究同種異體牙移植的免疫抑制方法和移植術(shù)的改進(jìn)，本研究采用了實(shí)驗(yàn)組免疫抑制劑未處理、免疫抑制劑（Tregs）處理，分別1、2、4、8周時(shí)間段采集實(shí)驗(yàn)，對(duì)比觀察免疫排斥反應(yīng)、術(shù)后植片存活率等。結(jié)果同種異體移植牙術(shù)后1周開始出現(xiàn)牙根吸收及周圍移植區(qū)的免疫排斥反應(yīng)，觀察牙根周圍的單核細(xì)胞浸潤(rùn)及局部淋巴結(jié)內(nèi)淋巴母細(xì)胞的產(chǎn)生。移植牙受體區(qū)域纖維血管組織長(zhǎng)入，根尖周圍牙周韌帶細(xì)胞大量破壞，組織血管吸收、壞死，大量的炎細(xì)胞浸潤(rùn)。分布于骨質(zhì)表面，形成骨吸收窩陷。免疫抑制劑未處理的實(shí)驗(yàn)組術(shù)后1周可持續(xù)增加排斥反應(yīng)，植片平均存活時(shí)間為（16.82±2.34）d，4周達(dá)到頂峰。免疫抑制劑處理的實(shí)驗(yàn)組術(shù)后2周開始出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)，至術(shù)后2周達(dá)到頂峰。植片觀察炎細(xì)胞浸潤(rùn)，伴有新生血管長(zhǎng)入牙槽骨周圍，組織切片存活時(shí)間顯著延長(zhǎng)（P＜0.01），為（40.52±1.23）d。免疫檢測(cè)結(jié)果表明同種異體移植接受組組織切片CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生數(shù)量不如CD4+T細(xì)胞多，其表達(dá)強(qiáng)度明顯高于CD8+T細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞。同種異體移植組未觀察CD8+T細(xì)胞，大部分收集于移植周圍區(qū)域。術(shù)后4周和8周兩組檢測(cè)值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證明Tregs免疫抑制方法在同種異體牙移植中可以取得有效的免疫抑制效果。

Coutinho等[13]提出CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞與移植排異反應(yīng)有密切聯(lián)系。CD4+T細(xì)胞和CD8+T能改變免疫抑制功能異常地指標(biāo)，其值也代表了試驗(yàn)的免疫穩(wěn)定，而且所測(cè)的指標(biāo)可較好地檢測(cè)免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生。在本研究免疫組化觀察中，CD4+T細(xì)胞表達(dá)明顯高于CD8+T細(xì)胞，分析異體牙移植免疫反應(yīng)發(fā)生是依靠于CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)反應(yīng)，此結(jié)果與本試驗(yàn)研究結(jié)果基本相符，說明CD4+T細(xì)胞和CD8+T值可以檢測(cè)免疫抑制的效果。

異體牙來源豐富，如果找到消除異體牙移植術(shù)后并發(fā)癥的免疫排斥反應(yīng)的抑制方法，延長(zhǎng)異體牙移植術(shù)后供體的存活時(shí)間，抑制免疫排斥反應(yīng)，誘導(dǎo)供體免疫耐受，將提高異體牙移植術(shù)的成功率，今后有待于深層的研究。本研究針對(duì)異體牙移植免疫排斥反應(yīng)，探求新的、安全有效的新型免疫抑制劑，為異體牙移植術(shù)在臨床上提供基本資料。

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