顧紹峰 彭榮梅 肖格格 馮云 洪晶

北京大學第三醫(yī)院眼科 眼部神經損傷的重建保護與康復北京市重點實驗室，北京 100191

角膜后彈力層剝除聯合自動角膜刀取材內皮移植術(Descemet stripping automated endothelial keratoplasty，DSAEK)具有排斥反應少、學習曲線短、手術風險小、術后視力恢復快等優(yōu)點，徹底推動了角膜內皮移植手術在全球的廣泛開展，并取代傳統的穿透角膜移植術成為目前治療角膜內皮疾病的主要方法[1]。然而隨著手術技術的日臻成熟，對手術效果的要求也越來越高。有研究發(fā)現，供體角膜內皮移植片越薄，則術后視力恢復越好，內皮細胞丟失率越低[2-3]。因而在傳統的DSAEK基礎上，發(fā)展出了薄植片手術方案，如超薄DSAEK[4]。但這一結論目前仍存在很多爭議，有大量研究發(fā)現供體植片厚度與術后視力、角膜內皮細胞密度(endothelial cell density，ECD)無關[5-7]，甚至有研究認為薄植片會增加角膜內皮細胞的丟失[8]。而中國人的眼部解剖結構與歐美等人群存在明顯差異。國外報道的DSAEK手術供體植片多為大植片，直徑多為8.5 mm或以上[9]，國內DSAEK手術的供體植片則多為小植片(直徑多為8.0 mm或以下)。而關于小植片DSAEK手術移植片厚度和大小對術后ECD的影響尚未見報道。本研究擬探討國內DSAEK術后2年供體植片的厚度和大小對ECD的影響，為符合國人眼部特點的小植片DSAEK手術提供研究基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采用系列病例觀察研究，收集2013年1月至2017年12月因角膜內皮功能失代償在北京大學第三醫(yī)院眼科中心行DSAEK手術的患者134例144眼，年齡4～88歲，平均(52.2±20.2)歲。其中男65例73眼，女69例71眼；右眼74眼，左眼70眼；術前平均眼壓(15.4±5.3)mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。所有患者均完成2年隨訪且資料完整。導致角膜內皮失代償的原因包括Fuchs角膜內皮營養(yǎng)不良14眼、其他類型角膜內皮營養(yǎng)不良11眼、白內障摘出術后54眼、抗青光眼術后19眼、玻璃體切割術后7眼、角膜移植術后20眼、眼外傷6眼和其他病因13眼。因術后3個月角膜供體中央植片厚度(central graft thickness，CGT)基本穩(wěn)定，故根據術后3個月CGT將患者分為薄植片組45眼、中等厚植片組66眼和厚植片組33眼，分別為供體CGT<100 μm、≥100～<150 μm和≥150 μm。按照角膜環(huán)鉆切割的供體植片大小分為小植片組31眼和大植片組113眼，供體植片直徑分別為≥7～<8 mm和≥8～<9 mm。本研究遵循《赫爾辛基宣言》，經北京大學第三醫(yī)院倫理委員會審核批準(批文號：IRB00006761-2008025)，所有患者術前均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1供體ECD檢查 術前采用角膜內皮鏡(HAI EB-3000XYZ，美國HAI Laboratories公司)測量供體ECD。將眼庫標準化處理的供體角膜移植片放入裝有保存液的玻璃瓶中，并放入HAI EB-3000XYZ型內皮顯微鏡的固定槽中，調節(jié)鏡頭位置，使內皮細胞顯示清晰，選定50～100個細胞，使用機器自帶內皮分析軟件(HAI CAS EB 2.10)對供體角膜ECD進行分析。

1.2.2活體角膜激光掃描共聚焦顯微鏡檢查 術后1、3、6、12和24個月，采用海德堡活體角膜激光掃描共聚焦顯微鏡(HRT3/RCM，德國Heidelberg公司)測量ECD。放大倍數為800倍，分辨率為1 μm，觀察視野為380 μm×380 μm。檢查前使用4 g/L鹽酸奧布卡因(日本參天制藥株式會社)對受檢眼進行表面麻醉1次，點用Vidisic眼凝膠(美國博士倫公司)，并蓋上一次性無菌角膜接觸帽。調整操縱臺高度固定受檢者下頜和前額，調整物鏡位置，使角膜接觸帽與角膜中央輕微接觸，預設其接觸的焦平面深度為0 μm。轉動焦平面調節(jié)環(huán)，獲得不同深度不同層次的圖像。檢查結束后，選取清晰的圖像存盤。檢查另一眼需換用新的無菌帽。使用設備自帶軟件對圖像進行分析并計算ECD。根據術后不同時間點ECD及其相對應的術前供體ECD，計算角膜內皮細胞丟失率，角膜內皮細胞丟失率=(術前供體ECD-術后ECD)/術前供體ECD。

1.2.3角膜中央總厚度和供體CGT測量 采用眼前節(jié)光相干斷層掃描儀AS-OCT(Visante OCT，德國Carl Zeiss公司)測量術前及術后角膜中央總厚度(central corneal thickness，CCT)和供體CGT。患者下頜置于下頜托上，注視鏡頭內的注視目標。調整患者固視角，使視軸與眼軸一致。采用AS-OCT高分辨率角膜模塊進行測量。掃描過程中，單擊瞳孔中央至最佳校準即可取像，采用設備自帶軟件對圖像進行分析。將測量光標移動至角膜中央位置，坐標顯示為(0，0)，測量頂點角膜上皮層至內皮層的厚度為CCT。內皮移植術后，供體移植片與受體植床之間存在高反光界面。同樣將測量光標移至角膜中央(0，0)位置，測量高反光界面至內皮層的厚度即為供體CGT。

1.3 統計學方法

采用SPSS 23.0統計學軟件(美國IBM公司)進行統計分析。計量資料數據經Shapiro-Wilk檢驗證實不符合正態(tài)分布，以M(Q1，Q3)表示。手術前后各時間點CCT及手術后各時間點供體CGT總體比較采用Kruskal-WallisH檢驗，兩兩比較采用Wilcoxon符號秩檢驗；采用Spearman相關系數分析術后24個月ECD與術前供體ECD、CGT及植片大小的關系；采用Kruskal-WallisH檢驗分析不同厚度植片組術前供體ECD以及術后各觀察時間點3個組角膜內皮細胞丟失率的差異；采用Mann-WhitneyU檢驗分析不同大小植片組術前供體ECD、術后3個月供體CGT以及術后各觀察時間點角膜內皮細胞丟失率的差異。采用雙側檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 手術前后CCT和手術后供體CGT比較

術前及術后1、3、6、12、24個月CCT分別為797.5(722.5，910.0)、641.5(590.5，730.0)、619.5(577.0，691.5)、625.0(572.5，699.0)、627.0(584.5，692.5)和623.0(578.0，692.0)μm，總體比較差異有統計學意義(H=259.008，P<0.001)，其中術后各時間點CCT明顯薄于術前，術后1、3、6、12、24個月的CCT分別與術前CCT相比，差異均有統計學意義(均P<0.05)。

術后1、3、6、12和24個月供體CGT分別為129.0(90.8，160.8)、115.5(93.0，146.0)、115.5(89.0，151.0)、112.5(94.3，146.8)和114.0(89.0，144.5)μm，總體比較差異有統計學意義(H=37.369，P<0.001)，其中術后1個月供體CGT與術后3個月相比差異有統計學意義(P<0.001)，術后3個月供體CGT分別與術后6個月、12個月、24個月相比，差異均無統計學意義(均P>0.05)。

2.2 術后不同時間點ECD和角膜內皮細胞丟失率變化

術前供體植片ECD為2 455.9(2 250.0，2 872.3)個/mm2，術后1、3、6、12、24個月ECD逐漸降低，角膜內皮細胞丟失率逐漸升高(表1)。

表1 術后各時間點ECD和角膜內皮細胞丟失率[M(Q1,Q3)]Table 1 ECD and endothelial cell loss rate at different time points after the surgery (M[Q1,Q3])時間眼數ECD(個/mm2)角膜內皮細胞丟失率(%)術后1個月1441 931.5(1 487.5,2 330.0)23.0(13.0,34.4)術后3個月1441 874.0(1 416.5,2 245.8)25.2(14.7,36.5)術后6個月1441 803.0(1 385.3,2 199.3)28.7(19.6,42.7)術后12個月1441 524.5(1 188.3,2 104.0)37.0(23.9,47.1)術后24個月1441 375.0(1 033.5,1 892.8)45.9(31.3,54.7) 注:ECD:內皮細胞密度 Note:ECD:endothelial cell density

2.3 術后24個月ECD與術前供體植片ECD、供體植片大小及供體CGT的相關性

Spearman相關性分析顯示，術后24個月時ECD與術前供體植片ECD呈強正相關(rs=0.783，P<0.001)，與供體植片大小和術后3個月時的供體CGT均無明顯相關性(rs=0.141，P=0.093；rs=-0.044，P=0.600)(圖1)。

圖1 術后24個月ECD與術前供體植片ECD、植片大小及供體CGT的相關性(Spearman相關分析，n=144) A：術后24個月ECD與術前供體植片ECD呈強正相關(rs=0.783，P<0.001) B：術后24個月ECD與供體植片大小無明顯相關性(rs=0.141，P=0.093) C：術后24個月ECD與術后3個月時供體CGT無明顯相關性(rs=-0.044，P=0.600) ECD：內皮細胞密度；CGT：中央植片厚度Figure 1 Correlations between 24-month postoperative ECD and donor graft ECD,donor graft size and donor CGT (Spearman correlation analysis,n=144) A:ECD at postoperatively 24 months was strongly positively correlated with the donor ECD (rs=0.783,P<0.001) B:There was no correlation between donor graft size and the 24-month postoperative ECD (rs=0.141,P=0.093) C:The 24-month postoperative ECD was not associated with donor CGT at postoperatively 3 months (rs=-0.044,P=0.600) ECD:endothelial cell density;CGT:central graft thickness

2.4 不同厚度供體CGT組術前ECD和術后角膜內皮細胞丟失率比較

薄植片組、中等厚植片組和厚植片組供體CGT分別為72.0(62.0，89.5)、118.5(111.8，135.3)和171.0(164.0，209.0)μm。3個組術前ECD分別為2 499.8(2 251.1，3 033.0)、2 458.5(2 250.0，3 013.0)和2 424.0(2 254.9，2 713.9)個/mm2，總體比較差異無統計學意義(H=0.368、P=0.832)。3個組術后各時間點角膜內皮細胞丟失率總體比較差異均無統計學意義(表2)。

表2 不同厚度供體CGT組術后各時間點角膜內皮細胞丟失率比較[M(Q1,Q3),%]Table 2 Comparison of endothelial cell loss rate among three groups at different time point after the surgery (M[Q1,Q3],%)組別眼數術后1個月術后3個月術后6個月術后12個月術后24個月薄植片組4524.6(13.0,38.1)28.1(15.9,41.7)28.0(17.1,42.0)34.3(19.6,47.4)40.8(31.3,55.5)中等厚植片組6622.4(13.8,31.4)21.3(12.3,31.1)28.4(21.1,41.7)36.8(25.0,44.3)47.3(31.6,54.0)厚植片組3324.1(12.4,40.3)31.0(17.8,39.3)30.2(16.0,43.9)41.5(16.6,53.6)49.1(30.1,54.8)H值1.6304.4050.2331.1840.079P值0.4430.1110.8900.5530.961 注:(Kruskal-Wallis H檢驗) CGT:中央植片厚度 Note:(Kruskal-Wallis H test) CGT:central graft thickness

2.5 不同供體植片大小組術前ECD、術后供體CGT及角膜內皮細胞丟失率比較

小植片組和大植片組植片直徑分別為7.5(7.5，7.5)mm和8.0(8.0，8.0)mm。2個組術前ECD和術后3個月時供體CGT比較差異均無統計學意義(Z=-0.002、-1.648，均P>0.05)(表3)。2個組術后各時間點角膜內皮細胞丟失率總體比較差異均無統計學意義(均P>0.05)(表4)。

表3 不同供體植片大小組術前ECD和術后CGT比較[M(Q1,Q3)]Table 3 Comparison of preoperative ECD and postoperative CGT between two groups (M[Q1,Q3])組別眼數術前ECD(個/mm2)術后3個月CGT(μm)小植片組312 329.5(2 252.3,3 033.0)107.0(88.0,139.0)大植片組1132 490.0(2 250.0,2 765.6)117.0(93.0,151.5)Z值-0.002-1.648P值0.9980.099 注:(Mann-Whitney U檢驗) ECD:內皮細胞密度;CGT:中央植片厚度 Note:(Mann-Whitney U test) ECD:endothelial cell density;CGT:central graft thickness

表4 不同供體植片大小組術后各時間點角膜內皮細胞丟失率比較[M(Q1,Q3),%]Table 4 Comparison of endothelial cell loss rate between two groups at different time points after the surgery (M[Q1,Q3],%)組別眼數術后1個月術后3個月術后6個月術后12個月術后24個月小植片組3119.7(11.5,29.6)23.5(12.9,31.5)30.9(20.9,43.7)41.4(24.4,52.2)49.0(36.3,57.2)大植片組11323.9(13.4,35.4)27.1(15.5,36.8)28.0(18.8,41.3)35.7(21.9,45.3)45.4(30.0,54.2)Z值-1.091-0.770-0.911-1.429-1.726P值0.2750.4410.3620.1530.084 注:(Mann-Whitney U檢驗) Note:(Mann-Whitney U test)

3 討論

有研究發(fā)現DSAEK術前，供體植片會產生“水腫”，其主要原因是供體角膜在進行切削時，植片浸泡于平衡鹽溶液中，并去除了角膜上皮層。而術后供體植片會發(fā)生“去水腫”作用，從而使其厚度變薄[10]。本研究發(fā)現，DSAEK術后1個月和3個月，CCT和供體CGT均明顯降低，3個月以后逐漸趨于穩(wěn)定。這表明DSAEK術后3個月時，植床與植片的炎癥反應基本消退，而植片內皮細胞的術源性損傷也趨于停止，ECD和功能趨于穩(wěn)定，從而使植床和植片的厚度基本穩(wěn)定。Di Pascuale等[11]研究發(fā)現，DSAEK術后供體植片厚度變薄，可從術后第1天的243 μm降至末次隨訪的148 μm。本研究也發(fā)現，供體CGT從術后1個月的129.0(90.8，160.8)μm降至術后3個月的115.5(93.0，146.0)μm。這一結果提示我們，DASEK術后供體植片會產生“去水腫”作用，因而術前準備供體移植片及評價手術療效時，應注意供體移植片厚度的變化。如術前植片厚度大于100 μm，術后植片厚度變薄，可能使原來的DSAEK變成超薄DSAEK。

通過上述分析，本研究發(fā)現術后3個月時供體CGT基本穩(wěn)定，故選取術后3個月的供體CGT分析DSAEK術后24個月ECD與術前供體植片ECD、供體植片大小和供體CGT的相關性。發(fā)現術后24個月ECD與術前供體ECD呈強正相關，而與供體植片大小和供體CGT無明顯相關性，這一結果與既往的一些研究結論相同。Lass等[12]研究發(fā)現，DSAEK術后3年ECD與術前供體ECD呈正相關，而與供體植片厚度無明顯相關性。而Lekhanont等[13]的研究也認為DSAEK術后5年的ECD與術前供體ECD呈正相關，而與供體植片的直徑不相關。

2012年，Busin等[14]進行的超薄DSAEK手術中所用供體植片厚度均小于100 μm，此后陸續(xù)很多研究發(fā)現，超薄DSAEK具有視力恢復快、術后高階相差小等優(yōu)點[15-16]，但供體CGT與DSAEK術后視力恢復關系仍存在一定爭議[17]。本研究結果發(fā)現，在隨訪的24個月內，厚植片組的角膜內皮細胞丟失率一直較高，僅術后1個月時低于薄植片組。術后3個月內薄植片組內皮細胞丟失率較高，可能與薄植片在DSAEK手術時展開困難、操作相對復雜有關；而術后6～24個月薄植片組的內皮細胞丟失率低于其他2個組，可能與術后3個月后植片穩(wěn)定、薄植片的角膜基質含量少、炎癥反應和排斥反應較輕以及損傷的內皮細胞恢復較快有關。厚植片組的角膜內皮細胞丟失率一直較高，考慮與手術過程中厚植片通過角膜切口進入前房時，角膜切口及植入器端口對內皮細胞的雙重擠壓作用，導致內皮細胞損傷相對較多有關；且其植片較厚，術后炎癥和排斥反應相對嚴重，導致內皮細胞損傷恢復不佳。但術后各觀察時間點，3個組之間角膜內皮細胞丟失率差異均無統計學意義。因此我們認為在DSAEK手術中，相對薄的供體植片術后角膜內皮細胞損失較小，內皮細胞丟失率可能較低。

本研究進一步分析發(fā)現，術前小植片組和大植片組間ECD以及術后3個月時供體CGT的差異均無統計學意義。術后1～3個月，小植片組的角膜內皮細胞丟失率低于大植片組，考慮與大植片通過角膜切口時，因切口對內皮細胞的擠壓作用，引起更多的角膜內皮細胞損傷有關；而術后6～24個月，大植片組的角膜內皮細胞丟失率低于小植片組，考慮可能與大植片含有更多的角膜內皮細胞及部分損傷的內皮細胞功能逐漸恢復有關。但術后各觀察時間點，2個組之間角膜內皮細胞丟失率差異均無統計學意義。因此我們認為在DSAKE手術中，相對大的供體植片術后內皮細胞損失較小，內皮細胞丟失率可能較低。

綜上所述，本研究結果顯示符合國人特點的小植片DSAEK手術在術后3個月時供體CGT趨于穩(wěn)定。術后24個月，ECD與術前供體ECD呈強正相關，而與供體CGT和植片大小無明顯相關性。供體植片越薄、直徑越大，術后遠期角膜內皮細胞丟失率越低，更有利于植片的長期存活。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明顧紹峰：數據整理、統計分析、論文撰寫；彭榮梅：采集數據、分析數據；肖格格、馮云：臨床信息的分析和解釋；洪晶：研究指導、論文修改及定稿