許智慧 任曉強 劉 妍 李曉東 王 耀 戴久增 徐東平

HBV感染引起的肝細胞病變主要由機體免疫反應引起，HBV特異性細胞毒性淋巴細胞（CTL）在清除細胞內(nèi)感染病毒中起關鍵作用，同時也與肝組織的免疫病理損傷關系密切。CTL作用靶細胞是通過識別HLA-I類分子遞呈的HBV抗原表位來實現(xiàn)，其對病毒的應答強度可能對乙型肝炎的進展產(chǎn)生重要影響。如果反應不足，病毒難以清除而使感染慢性化。如果反應過強，引起肝細胞廣泛的嚴重損傷，從而使病情加重，嚴重者可造成肝衰竭[1]。中國人群中最常見的人類白細胞抗原（HLA-A）基因型是 HLA-A11、A2、A24及A33，已鑒定的HBV CTL表位主要為HLA-A2限制性，其他HLA-A限制性HBV CTL表位尚缺乏系統(tǒng)的研究[2]。我們以往的研究表明，急性乙型肝炎（AHB）較慢性乙型肝炎（CHB）患者HBV特異性 CTL反應強度高，HBV基因型對CTL表位有較大的影響。慢性重型乙型肝炎（chronic severe hepatitis B，CSHB）較CHB患者肝組織浸潤的CD8+T淋巴細胞顯著增高[3，4]。我們推測HBV特異性CTL表位變異與HBV感染的慢性化和重癥化相關，但目前尚未見報道。本文對HLA-A2和A11陽性的AHB、CHB和CSHB患者HBV 核心蛋白（C）和多聚酶蛋白（Pol）中的特異性CTL表位變異進行了檢測分析。

資料與方法

一、病例資料 2007年8月至2008年5月我院收治的516例乙型肝炎患者，247例為HLA-A2陽性，其中AHB 67例（男52例，女15例，平均年齡37.3±11.9歲），CHB 109例（男 93例，女 16例，平均年齡 39.7±11.5歲），CSHB 71例（男 55例，女16例，平均年齡48.6±12.4歲）；220例為HLA-A11陽性，其中AHB 67例（男54例，女13例，平均年齡37.9±10.7歲），CHB 107例（男92例，女15例，平均年齡39.3±13.7歲），CSHB 46例（男 40例，女 6例，平均年齡46.6±13.1歲）。其余49例患者為其他HLA-A基因型。診斷符合2000年西安會議制訂的《病毒性肝炎防治方案》的標準[5]。

二、HLA-A分型 參照文獻[6]報道的方法進行HLA-A2和HLA-A11分型鑒定。利用人淋巴細胞分離液分離患者外周血單個核細胞（PBMC），嚴格按照Qiagen DNA mini試劑盒（德國，Qiagen）說明提取患者PBMC基因組DNA，按照報道的SSP-PCR法設計合成特異性引物，進行PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，根據(jù)電泳條帶確定HLA-A2分型。

三、HBV C區(qū)與Pol區(qū)基因擴增 采用DNAOUT試劑（四川，天澤公司），按照說明書提取血清HBV DNA。Pol基因（nt2307-1623）橫跨了整個HBV基因組的80%，一次PCR雖然可獲得其全部序列，但敏感性較差；為了提高Pol基因PCR擴增敏感性和獲得全部C區(qū)序列，我們采用一管式巢式PCR[7]兩片段拼接法。片段 1：HBV nt3194～1797（1818bp），包括全部的S基因序列和部分 Pol基因序列；片段 2：HBV nt1777～274（1712bp），包括全部的 C 基因序列和部分Pol基因序列，片段1與片段2有295bp的重疊部分，分別PCR得到片段1和片段2后，用DNAstar分析軟件進行序列拼接，以獲得完整的Pol基因序列。

片段 1： 第一輪 引物為：P1（上游）5’-AGTCAGGAAGACAGCCTACTCC-3’，P2（下游）5’-AAAAAGTTGCATGGTGCTGG-3’；第二輪引物為：P3（上游）5’-ATCCGCAGGCCATGCAGTGG-3’，P4（下游）5’-CCAATTTATGCCTACAGCCTC-3’。第一輪反應條件為：94℃ 3min；94℃ 45sec，59℃～51℃ 50sec（每2個循環(huán)減 2℃），72℃ 100sec，10個循環(huán)；94℃45sec，56℃ 50sec，72℃ 100sec，30個循環(huán)；72℃7min。第二輪反應條件為：94℃ 3min；94℃ 40sec，55℃ 45sec，72℃ 90sec，35 個循環(huán)；72℃ 7min。擴增片段長度為1818 bp。

片段 2：第一輪引物為：P1*（上游）5’-CTTGAGGCATACTTCAAAGAC-3’，P2* （下游）5’-TGAGGCATAGCAGCAGGATG-3’；第二輪引物為：P3*（上游）5’-GAGGCTGTAGGCATAAATTGG-3’，P4*（下游）5’-TGAGAGAAGTCCACCACGAG-3’。第一輪反應條件為：94℃ 3min；94℃ 40sec，59℃～51℃40sec（每 2個循環(huán)減 2℃），72℃ 80sec，10個循環(huán)；94℃ 40sec，56℃ 40sec，72℃ 80sec，30 個循環(huán)；72℃7min。第二輪反應條件為：94℃ 3min；94℃ 35sec，55℃ 35sec，72℃ 70sec，35 個循環(huán)；72℃ 7min。擴增片段長度為1712bp。

四、DNA序列分析 PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定和回收純化后進行DNA序列測定，測序由北京利嘉泰成公司完成。測序引物為：片段1：P5（正向）5’-CATCCTGCTGCTATGCCTCA-3’；P6（反向）5’-AGAGGTTCCTTGAGCAGG-3’，P7（正向）5’-CCTATTGATTGGAAAGTATGTC-3’，P8 （正向）5’-GACGTCCTTTGTTTACGTCC-3’；片段 2：P9（正向）5’-GGTGTCTTTTGGAGTGTGGAT-3’；P10（反向）5’-AGGGAGTTCTTCTTCTAGG-3’，P11 （正向）5’-GTGGGTCACCATATTCTTGG-3’，P12（正向）5’-TTGGTGTCTTTTGGAGTGTG-3’。選擇文獻報道的4個HLA-A2限制性和1個HLA-A11限制性的C基因特異性CTL表位以及5個HLA-A2限制性的Pol基因特異性CTL表位序列做為參考序列，用Vector NTI軟件對測定基因序列的推導氨基酸序列與參考序列進行比較。

五、HBV基因分型 根據(jù)所測定的HBV S基因序列，片段 1：在 HBV nt3194～1797 中 nt155～835 為 S基因序列。用ViursBlast軟件做相似性計算和比較以進行基因分型。

六、統(tǒng)計學處理 應用SAS9.0軟件對三組患者間各個表位變異的顯著性差異進行卡方檢驗，P<0.05為具有差異顯著，P<0.01為具有差異極顯著。

結果

一、HLA-A2與HLA-A11分型的鑒定 見表1。

表1 3組患者HLA-A2/A11分型結果

二、CTL表位序列變異差異分析 在10個分析的CTL表位中檢出了不同程度的變異，B型和C型HBV基因型對一些表位的變異有明顯影響。AHB、CHB與 CSHB患者間A11:C88-96（YVNVNMGLK）表位變異發(fā)生頻數(shù)有顯著性差異（P<0.05，表2），而HLA-A2無顯著性差異（數(shù)據(jù)未給出）。對三組間HBV B基因型患者進行比較時，A2:P455-463和A2:P816-824表位有極顯著性差異（P<0.01，表3）；三組間HLA-A11 B基因型患者無顯著性差異。對三組間HBV C基因型患者進行比較時，HLA-A2患者無顯著性差異（數(shù)據(jù)未給出），而A11:C88-96表位有極顯著性差異（P<0.01，表 2）。

表2 3組患者HLA-A11特異性CTL表位變異個數(shù)的比較

表3 3組B基因型患者HBV C蛋白和Pol蛋白HLA-A2特異性CTL表位變異（%）

三、CTL表位變異氨基酸分析 在多數(shù)變異表位中有多個氨基酸發(fā)生了替換，少數(shù)表位只有一個氨基酸發(fā)生改變，如C18-27、C115-124和P816-824表位。多數(shù)同一變異位點的替換氨基酸為同一種氨基酸（表4）。

表4 患者HBV C蛋白和Pol蛋白特異性CTL表位的主要變異氨基酸

討論

HBV有8種基因型，我國主要以B基因型和C基因型為主，基因型對HBV感染的發(fā)病程度可能有一定的影響[8]。HBV C基因區(qū)編碼的核心蛋白是組成病毒核衣殼的主要多肽，表達形式為HBcAg；C基因區(qū)相對保守，在持續(xù)HBeAg（+）/ALT正常的免疫耐受期和病毒感染20年以上都可能沒有變異[9]。然而，C基因變異較常見于病變活動的慢性乙型肝炎[10]。Pol基因是最長的ORF，橫跨了HBV整個基因組的80%，并且與其它3個ORF相重疊。Pol蛋白翻譯起自HBV前基因組RNA，其產(chǎn)物為843個氨基酸的多功能蛋白。核心蛋白、外膜和多聚合酶蛋白都是Th和CTL細胞的靶抗原[11]。

HBV特異性CTL應答是機體清除肝細胞內(nèi)HBV的關鍵因素。CTL通過識別和結合HBV抗原表位發(fā)揮作用。CTL表位由病毒蛋白中的短肽組成，并由HLA-I類分子遞呈。CTL的特異性由T細胞受體決定，T細胞受體與HLA-I分子呈遞的病毒表位間形成互補的空間結構而具有較高的親和力，如果表位中氨基酸發(fā)生變異，則可以影響互補結構而降低與T細胞受體的親和力。研究表明病毒的CTL表位變異可能是HBV逃逸免疫應答、引起乙型肝炎慢性化的重要機制[12]。一般認為HBV特異性CTL可以通過細胞裂解與非裂解兩種方式清除感染病毒，但對影響CTL作用方式取向的因素和調(diào)節(jié)CTL反應強度的機制還未得到闡明。有研究表明，重型乙型肝炎患者外周血和肝組織中浸潤的大量HBV特異性CTL細胞可通過釋放的大量穿孔素和細胞因子導致肝細胞的大量死亡[13]。然而，另有研究表明，當HBV特異性CTL應答不能控制病毒復制時，可引起大量非特異性CTL浸潤，是造成肝細胞病理損傷的主要原因[14]。因此，目前對HBV特異性CTL對乙型肝炎重癥化的影響尚不明確。

通過對較大樣本量的AHB、CHB和CSHB患者進行HBV核心蛋白和多聚合酶蛋白特異性CTL表位變異發(fā)生頻率的比較，以了解HBV特異性CTL在乙型肝炎重癥化發(fā)生中的作用。由于HBV特異性CTL表位的作用受HLA-A限制，同時某些表位在不同基因型間變異較大，我們在研究中首先通過HLA-A2和HLA-A11分型選擇陽性患者，并通過S基因測序?qū)颊逪BV基因型進行了檢測。結果顯示，急性、慢性和慢性重型肝炎HLA-A2陽性患者，表位變異發(fā)生率無統(tǒng)計學差異；在三組HBV B基因型感染患者，P455-463和P816-824表位變異發(fā)生頻率有極顯著性差異；在三組間HBV C基因型患者，表位變異頻數(shù)無統(tǒng)計學差異。在三組HLA-A11陽性患者，C88-96表位變異發(fā)生率有顯著性差異；在三組A11陽性的HBV C基因型患者，C88-96表位變異發(fā)生頻率有極顯著性差異；在三組HBV B基因型患者，表位變異頻率無統(tǒng)計學意義。值得注意的是，在三組患者之間有的CTL表位變異率增高，有的則降低，提示各個表位在乙型肝炎病毒誘導的機體CTL免疫應答中的作用有所不同。文獻報道和我們以往的研究結果也發(fā)現(xiàn)在不同患者針對各個HBV抗原表位的CTL頻率和反應強度并不一致。

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