張彩華 姜妙娜 李寒姝 袁麗君 趙赫男 李 驄 賈玉杰

肝纖維化是各種原因所致的反復(fù)肝損傷在組織修復(fù)過(guò)程中細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的構(gòu)成改變和過(guò)度沉積的結(jié)果[1，2]。肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）是合成ECM的主要細(xì)胞，激活的HSC大量增殖，發(fā)生表型改變，轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞（myofibroblast，MFB）并分泌過(guò)多的ECM沉積于肝臟[3～5]。核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是眾多細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)表達(dá)的主要轉(zhuǎn)錄因子，是多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的匯聚點(diǎn)[6]。NF-κB不僅可以介導(dǎo)免疫應(yīng)答和病毒復(fù)制，而且與HSC的激活密切相關(guān)[7，8]。中藥肝復(fù)康是本室的研究驗(yàn)方，具有消炎、保護(hù)肝細(xì)胞、減輕ECM沉積和抑制HSC增殖的作用[9～11]。本研究探討了肝復(fù)康對(duì)大鼠肝組織NF-κB和基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）表達(dá)的影響。

材料與方法

一、動(dòng)物和試劑 清節(jié)級(jí)SD大鼠50只，雌雄不限，體質(zhì)量180～220g，由本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（遼）2004-0017]。TrizolTM試劑盒（Invitrogen公司）；RT-PCR兩步法試劑盒（北京天根）；兔抗NF-κBp65多克隆抗體（武漢博士德）。引物：設(shè)置β-actin為參照，由大連TAKARA公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

二、中藥的制備 肝復(fù)康由柴胡、當(dāng)歸（補(bǔ)血合血）、黃芪（益氣）、赤芍、白芍（活血化瘀）、丹參（活血化瘀）等組成。其無(wú)菌原液由本校中西醫(yī)結(jié)合研究所按既定的工藝制備（1.95g/mL）。

三、動(dòng)物模型的制備與處理 SD大鼠50只，正常喂養(yǎng)1周后，被隨機(jī)分為正常對(duì)照組（C）12只，模型組（M）7只，小劑量治療組（LT）10只、中劑量治療組（MT）11只和大劑量治療組（HT）10只。造模動(dòng)物給予橄欖油稀釋的10%四氯化碳5ml.kg-1皮下注射，每周2次，共12周；正常對(duì)照組以同樣方法皮下注射生理鹽水。大、中和小劑量治療組則于造模第9周后分別以 3125mg.kg-1.d-1、312.5 mg.kg-1.d-1和 31.25mg.kg-1.d-1（溶于10ml/kg生理鹽水）肝復(fù)康灌胃至20周。于12周末處死模型組動(dòng)物，其余各組大鼠于第20周末處死，迅速取出肝組織，稱(chēng)濕重。從肝右葉中部切取肝組織2塊，一塊用10%甲醛固定，制備石蠟切片；另一塊置于-70℃冰箱保存，備檢。

四、肝組織病理學(xué)檢查 石蠟切片，常規(guī)HE染色。組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下[12]：0，肝組織結(jié)構(gòu)正常，無(wú)增生和膠原纖維形成；1+，中央靜脈周?chē)倭康哪z原纖維形成；2+，膠原纖維明顯擴(kuò)展，但無(wú)纖維間隔；3+，假小葉形成；4+，肝臟結(jié)構(gòu)破壞明顯，纖維間隔增厚，假小葉增多。

五、肝組織NF-κB水平檢測(cè) 采用Weatern Blot法。組織蛋白的提取參照文獻(xiàn)[13]，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度。取50μg蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE，用5%濃縮膠和12%分離膠和Tris-甘氨酸電泳緩沖液電泳，電壓20mA，PVDF膜進(jìn)行半干式電轉(zhuǎn)移40分鐘。將膜放入5%脫脂奶粉中封閉3h，加入兔抗NF-κB p65多克隆抗體（工作濃度1:100，武漢博士德生物技術(shù)有限公司）4℃過(guò)夜，TBST漂洗10min×3，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔 IgG（1∶3000），37℃孵育 1h，TBST漂洗10min×3。采用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色反應(yīng)，重復(fù)3次，結(jié)果用光密度掃描儀記錄。

六、肝組織 NF-κB、MMP-2和 TIMP-2 mRNA 水平的檢測(cè) 采用RT-PCR法。提取RNA，合成cDNA，分別取NF-κB、MMP-2和 TIMP-2引物（20μmol/L）各0.5μL進(jìn)行PCR擴(kuò)增。取5μl擴(kuò)增產(chǎn)物在TBE緩沖液中行1%瓊脂糖凝膠電泳，使用凝膠成像儀拍照并進(jìn)行圖像分析。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS12.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。所有數(shù)據(jù)均用表示，組間比較采用單因素方差分析，采用LSD法進(jìn)行兩兩比較。采用Pearson法進(jìn)行相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異有顯著性意義。

結(jié)果

一、肝復(fù)康對(duì)肝組織病理學(xué)的影響 模型組大鼠可見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，大量纖維組織增生，部分包繞分割肝細(xì)胞形成假小葉，肝細(xì)胞腫大，脂肪變性明顯，部分有壞死（圖1b）。與模型組相比，中劑量肝復(fù)康治療組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)明顯改善，肝細(xì)胞水腫好轉(zhuǎn)，脂肪變性明顯改善，膠原纖維增生明顯減輕，纖維間隔變細(xì)（圖1c）。大、小劑量治療組肝組織結(jié)構(gòu)也有所改善，但效果較中劑量治療組差。各組肝組織纖維化程度評(píng)分見(jiàn)表2。

圖1 肝組織病理學(xué)變化（HE，×200）

表2 各組大鼠肝臟病理學(xué)評(píng)分

二、肝復(fù)康對(duì)NF-κB蛋白表達(dá)及mRNA水平的影響 模型組NF-κB蛋白表達(dá)明顯升高，與正常組比有顯著性差異（P<0.01）；中劑量治療組NF-κB表達(dá)較模型組明顯下降，差異有顯著性（P<0.01）；大劑量治療組和小劑量治療組NF-κB表達(dá)與模型組比無(wú)明顯差異（圖2）；RT-PCR檢測(cè)結(jié)果具有類(lèi)似的變化趨勢(shì)（圖3）。

圖2 NF-κB蛋白表達(dá)情況

圖3 NF-κB mRNA水平

三、肝復(fù)康對(duì)MMP-2和TIMP-2mRNA水平的影響 正常對(duì)照組大鼠肝組織MMP-2和TIMP-2mRNA水平較低；在模型組大鼠肝組織，兩者mRNA水平明顯上調(diào)，與正常對(duì)照組比，有顯著性差異（P＜0.01）；中劑量治療組大鼠肝組織MMP-2和TIMP-2mRNA水平較模型組明顯下調(diào)（P＜0.01），而與正常對(duì)照組比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；小劑量和大劑量治療組大鼠肝組織MMP-2和TIMP-2mRNA水平較模型組也明顯下調(diào)（P＜0.05，圖 4，表 3）。

圖4 MMP-2和TIMP-2mRNA水平

表3 各組MMP-2和TIMP-2 mRNA水平（光密度值）

四、NF-κB mRNA與 MMP-2和 TIMP-2 mRNA水平的相關(guān)性分析 見(jiàn)表4。

表4 各組MMP-2和TIMP-2與NF-κB mRNA水平的相關(guān)性分析

討論

近年來(lái)，有學(xué)者用NF-κB抑制劑處理大鼠活化的HSCS，發(fā)現(xiàn)HSCS凋亡增多，提示NF-κB有抗HSCS凋亡的作用[14～16]。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，肝復(fù)康治療能夠明顯地抑制NF-κB的表達(dá)，其中中劑量治療組的抑制效果最為明顯。同時(shí)發(fā)現(xiàn)肝復(fù)康能減少NF-κB mRNA水平，從而抑制HSCS的增殖，減少炎癥反應(yīng)。

研究表明，維持ECM正常代謝的MMPS與TIMPS之間分泌失衡是導(dǎo)致多種組織纖維化的重要因素之一[17]。我們檢測(cè)MMP-2和TIMP-2 mRNA水平，結(jié)果表明肝纖維化大鼠肝組織MMP-2和TIMP-2 mRNA水平較正常組明顯增加，而與模型組比，肝復(fù)康治療組大鼠肝組織MMP-2和TIMP-2 mRNA水平顯著降低，說(shuō)明肝復(fù)康同時(shí)也影響了MMP-2和TIMP-2的表達(dá)。

研究NF-κB信號(hào)通路與MMP-2和TIMP-2基因表達(dá)之間的關(guān)系表明，三者表達(dá)呈顯著正相關(guān)（P＜0.05或P＜0.01）。因此，我們推測(cè)在肝纖維化發(fā)生過(guò)程中，NF-κB可能通過(guò)抑制HSCs的凋亡，從而增加MMP-2的表達(dá)，而MMP-2的過(guò)表達(dá)使TIMP-2表達(dá)也隨之上調(diào)，但其中的分子生物學(xué)機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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