閔 峰 王素美 黃文琪

據(jù)估計(jì)，全球丙型肝炎病毒（HCV）感染者達(dá)1.7億人[1]。HCV感染人體后極易慢性化，且與肝硬化和肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。HCV包膜糖蛋白高變區(qū)（hypervariable region，HVR）存在中和抗原表位，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體，能阻止HCV感染；另一方面，高變區(qū)呈高度變異，易發(fā)生抗原漂移，逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視，使感染慢性化。我們針對HCV高變區(qū)（HVR1:390～411aa）設(shè)計(jì)并合成了多抗原肽（MAP）序列，并用MAP免疫家兔后獲得高效價(jià)的免疫血清，證實(shí)其具有良好的免疫原性[2]。本研究在建立HCV感染外周血單個(gè)核細(xì)胞的基礎(chǔ)上[3]，用抗MAP血清在體外阻斷HCV感染外周血單個(gè)核細(xì)胞，為研制HCV分子疫苗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料 取經(jīng)RT-PCR法檢測證實(shí)的HCV RNA陽性感染患者血清，采用ELISA法檢測為抗HCV-IgG陽性，而其它肝炎病毒標(biāo)志物均陰性，血清ALT正常；高效價(jià)兔抗MAP血清（1:40960）具有良好的免疫原性[2]，無菌采集血清、分裝，凍存于-80℃冰箱。用前經(jīng)56℃30min滅活補(bǔ)體；免疫組化試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司；抗HCV NS5單克隆抗體由北京大學(xué)肝病研究所提供；原位雜交試劑：Dig標(biāo)記的HCV正鏈寡核苷酸探針為參照Bukh等[4]的HCV5' 非 編 碼 區(qū) 探 針 序 列 （-95～-56nt）5'-CT GCTAGCCGACTAGTGTTGGGTCCGCGAAACCGCTTGTGG-3'，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院二所制備和純化；堿性磷酸酶標(biāo)記的地高辛抗體、雜交液、封閉劑和NBT/BCIP溶液均為德國寶靈曼（Boehringer Manheim）公司產(chǎn)品；檢測HCV RNA的RT-PCR試劑：引物由上海生物工程有限公司合成并純化，由內(nèi)引物擴(kuò)增HCVcDNA，長度為474bp。裂解液Tripure為德國寶靈曼公司產(chǎn)品；逆轉(zhuǎn)錄酶（AMV）、RNA酶抑制劑（RNasin）、無 RNA 酶、Taq 酶、dNTP、MgCl2 等為美國Promega公司產(chǎn)品。

二、兔抗MAP血清體外阻斷HCV感染 外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離見參考文獻(xiàn)[3]，即將分離的HCV RNA陽性者外周血單個(gè)核細(xì)胞，接種于25ml培養(yǎng)瓶，每瓶3ml或12孔培養(yǎng)板，每孔1ml，輕輕搖勻，置入37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18h，棄去培養(yǎng)上清，用培養(yǎng)基反復(fù)沖洗3次，留取最后一次洗滌液待檢。然后，再加入等體積新鮮完全培養(yǎng)液，每1～2天更換培養(yǎng)基，在培養(yǎng)過程中始終保持總體積不變。設(shè)感染組、阻斷組和對照組。阻斷組：取兔抗MAP血清，與血清HCV RNA陽性血清按照1:1、5:1和10:1比例混合，加入到正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞。將生長良好的細(xì)胞加入12孔培養(yǎng)板中，每孔終體積為1ml，16～18h后，棄去培養(yǎng)上清，用培養(yǎng)基反復(fù)沖洗3次，留取最后一次洗滌液待檢。然后，再加入等體積新鮮完全培養(yǎng)基，每1～2天更換培養(yǎng)基，在培養(yǎng)過程中始終保持總體積不變；兔對照組：取未經(jīng)免疫的正常兔血清，與HCV RNA陽性者外周血單個(gè)核細(xì)胞按照1:1、5:1和10:1比例混合，其它過程同阻斷組；人對照組：取正常人血清，與HCV RNA陽性者外周血單個(gè)核細(xì)胞按照1:1、5:1和10:1比例混合，其它過程同阻斷組。

三、細(xì)胞或培養(yǎng)上清HCV RNA的檢測 采用RT-PCR法。檢測HCV正鏈RNA時(shí)，在逆轉(zhuǎn)錄體系中加入外引物負(fù)鏈，檢測負(fù)鏈時(shí)加入外引物正鏈。第1次 PCR 循環(huán)參數(shù)為：94℃1min，54℃1min，72℃1min，35個(gè)循環(huán)；第2次PCR循環(huán)參數(shù)為：94℃1min，54℃30s，72℃1min，35個(gè)循環(huán)。由內(nèi)引物擴(kuò)增HCVcDNA長度為474bp。取PCR擴(kuò)增液10μl，與1μl加樣緩沖液（0.25%溴酚藍(lán)，40%蔗糖）混合，上樣于含溴化乙錠的2.0%瓊脂糖凝膠，于1TAE緩沖液中，在5V/cm電壓下電泳30～60min，紫外線燈下觀察474bp處有熒光帶者即為陽性。

四、外周血單個(gè)核細(xì)胞HCV NS3和NS5特異性抗原的檢測 采用免疫組化和原位雜交法。具體操作過程參照《實(shí)用免疫細(xì)胞化學(xué)與核酸分子雜交技術(shù)》[5]及《非放射性雜交技術(shù)》[6]和試劑說明書。

結(jié)果

一、細(xì)胞和培養(yǎng)上清HCV RNA水平 在感染組細(xì)胞培養(yǎng)第3天，可檢出細(xì)胞和上清液HCV RNA陽性，持續(xù)至第19天，而在按1:1血清混合阻斷組第3天至第9天，可檢出細(xì)胞和上清液HCV RNA陽性，而到第11天則未再檢出，在5:1和10:1阻斷組，細(xì)胞和上清中更快即檢測不出HCV RNA；對照組的檢測情況與感染組結(jié)果相似（表1和圖1、圖2）。在接種后第3～15天，感染組細(xì)胞內(nèi)可見陽性的藍(lán)紫色顆粒，呈胞漿型（圖3），而在阻斷組（5:1和10:1阻斷），細(xì)胞內(nèi)未見藍(lán)紫色雜交信號。

圖1 感染組和對照組細(xì)胞HCV RNA的檢測

圖2 阻斷組（血清按1:1阻斷）細(xì)胞HCV RNA的檢測

圖3 感染組細(xì)胞HCV RNA呈胞漿型表達(dá)（原位雜交，100×）

二、細(xì)胞HCV NS3和HCV NS5抗原的表達(dá)情況 在感染組和對照組，在接種后第3～15天細(xì)胞內(nèi)可見HCV NS3和HCV NS5抗原呈胞漿型表達(dá)，未見胞核型表達(dá)，陽性細(xì)胞呈點(diǎn)狀和散在分布，彌漫性分布少見；而在阻斷組（5:1和10:1阻斷），細(xì)胞內(nèi)未見特異性抗原表達(dá)。

討論

HCV感染機(jī)體后能否產(chǎn)生保護(hù)性免疫一直是人們爭論的問題，也是HCV分子疫苗研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。研究表明，HCV包膜糖蛋白E2/NS1的HVR確實(shí)含有重要的B細(xì)胞線形表位，編碼蛋白質(zhì)能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體[7～9]，但由于HVR1高度變異，易產(chǎn)生眾多的突變株或準(zhǔn)種，逃避機(jī)體先前產(chǎn)生的抗HVR1的識別，其抗HVR1部分或完全不具有中和作用。

HCV感染者血清中存在的抗HVR1或兔抗HVR1免疫血清能部分阻斷HCV感染培養(yǎng)細(xì)胞[10，11]。本研究在感染細(xì)胞基礎(chǔ)上[3]，用抗兔MAP血清與已感染外周血單個(gè)核細(xì)胞混合后接種培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)抗MAP血清能阻斷細(xì)胞內(nèi)和上清中HCV的繼續(xù)感染[3]。

抗MAP血清對已感染的外周血單個(gè)核細(xì)胞有部分阻斷作用，啟示以此為基礎(chǔ)繼續(xù)篩選HVR1區(qū)中和抗原表位，結(jié)合HVR1區(qū)C端保守氨基酸位點(diǎn)，重新設(shè)計(jì)并合成多抗原肽，可為深入研究HCV分子疫苗提供思路。

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