蔡明夷,柯才煥,郭 峰,王桂忠,王志勇,王藝?yán)?/p>

(1.廈門大學(xué) 海洋技術(shù)與工程系,近海海洋環(huán)境科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建廈門 361005;2.集美大學(xué) 水產(chǎn)生物技術(shù)研究所,福建廈門 361021)

雜色鮑(Haliotis diversicolor)和盤鮑(H.discus discus)是中國最重要兩種養(yǎng)殖鮑,原產(chǎn)地分別為中國臺灣和日本。雖然它們的親緣關(guān)系較遠(yuǎn),但是這兩種鮑雜交可以產(chǎn)生后代,并存活至性成熟[1],但存活后代為含有少量父本基因的雌核發(fā)育二倍體[2]。遠(yuǎn)緣雜交具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值和潛力。親和程度較高的雜交組合,可以直接利用雜交 F1的雜種優(yōu)勢;而親和程度低的雜交組合,也可能在存活后代中篩選出寶貴的育種中間材料和遺傳學(xué)研究材料。在胚胎和幼體階段,雜交 F1就可能表現(xiàn)出雜種優(yōu)勢[3-4]或遠(yuǎn)交不親和[5-6]。另外,胚胎發(fā)育速度和早期成活率也是分析雜交親和程度和后代遺傳本質(zhì)的輔助依據(jù)。因此,本文比較研究雜色鮑與盤鮑正反交 F1及其親本自繁后代的早期生物學(xué)表現(xiàn),主要包括正反交 F1和親本自繁后代的卵裂速度和孵化速度,以及雜色鮑與盤鮑雜交 F1和雜色鮑自繁幼體的成活率,以期為雜交 F1的后續(xù)應(yīng)用開發(fā)提供依據(jù),也為進(jìn)一步研究雜交產(chǎn)生雌核發(fā)育二倍體的機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 親鮑與催產(chǎn)

雜交親本雜色鮑和盤鮑分別由中國臺灣和日本引種, 在福建省東山養(yǎng)殖傳代。親鮑催產(chǎn)采用陰干、紫外線照射過的海水刺激和流水刺激的方法。配子開始排放時(shí),將正在排放的親鮑轉(zhuǎn)移到單獨(dú)的容器中產(chǎn)卵、排精。操作全過程,同種的雌雄個(gè)體間保持5 m以上的距離,同時(shí)所有的表面及器皿在每一步操作前先用淡水浸洗過,以防止同種精子污染發(fā)生?；旌蟿偱欧诺穆炎雍托迈r精液,授精方法參見蔡明夷等的描述[7]。試驗(yàn)包括正反交和父母本自繁4個(gè)組合：雜色鮑♀×雜色鮑♂、雜色鮑♀×盤鮑♂、盤鮑♀×雜色鮑♂和盤鮑♀×盤鮑♂,下文簡為SS、SJ、JS和JJ。

1.2 胚胎發(fā)育速度的觀察及統(tǒng)計(jì)

授精后,胚胎在22～23 ℃下孵育,每隔5 min取樣,每個(gè)樣本中卵數(shù)不少于 200個(gè),用 2%福爾馬林固定。取樣結(jié)束后,在解剖鏡下檢查記錄樣品中處于各細(xì)胞期的卵數(shù)和總卵數(shù),計(jì)算出各細(xì)胞期胚胎的百分比。以授精時(shí)間為橫坐標(biāo)、各細(xì)胞期胚胎的百分比為縱坐標(biāo)作圖,并用Gussian模型擬合(Origin 7.0),計(jì)算出胚胎發(fā)育至各細(xì)胞期的時(shí)間,其中,μ為平均值,σ為標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。

參照 Park[8]描述的方法,以胚胎卵裂次數(shù)為橫坐標(biāo),授精時(shí)間為縱坐標(biāo),用胚胎處各細(xì)胞期的時(shí)間數(shù)據(jù)作圖,并作線形擬合(Y=A+BX,OriginPro7.0),計(jì)算出不同交配組合的卵裂周期間隔時(shí)間(το＝B)。

每組挑出 200個(gè)發(fā)育卵,轉(zhuǎn)移到結(jié)晶皿中用膜濾海水培養(yǎng),用于觀察孵化時(shí)間。每20 min,在體視鏡下觀察,計(jì)未孵化卵數(shù)(n),并依此計(jì)算出各觀察時(shí)間的孵化率(H),計(jì)算公式為Hi= (200-ni)/200。以授精時(shí)間為橫坐標(biāo)、孵化率為縱坐標(biāo)作圖,用Sigmoidal擬合工具擬合后,查找出孵化率為 50%的時(shí)間作為孵化時(shí)間。

1.3 成活率觀察和統(tǒng)計(jì)

將2日齡SJ幼體及JJ幼體按每孔30只左右加入預(yù)接了矮小卵型藻的6孔培養(yǎng)板中,每組3板,共18孔。培養(yǎng)海水中含20 mg/ L青霉素和鏈霉素。將培養(yǎng)板放置在25 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔24 h觀察記錄1次,并清理死亡個(gè)體。成活率＝存活幼體數(shù)/總投放幼體數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 胚胎發(fā)育速度

圖1示授精后不同取樣時(shí)間,自繁和雜交組合SS、JJ、SJ和JS中,2細(xì)胞期、4細(xì)胞期、8細(xì)胞期和16細(xì)胞胚胎的百分比,及其高斯擬合圖。利用高斯擬合,計(jì)算出SS、JJ、SJ和JS交配組合中,胚胎處2細(xì)胞期、4細(xì)胞期、8細(xì)胞期和16細(xì)胞期的時(shí)間,結(jié)果如圖2所示。自繁組合SS和JJ處2細(xì)胞期的時(shí)間分別為授精后 45.3 min±8.9 min和 59.3 min±8.9 min,雜交組合SJ和JS的處2細(xì)胞期的時(shí)間分別為授精后 69.3 min±17.5 min和 71.7 min±5.8 min?？梢?SJ和JS兩雜交組合第一次卵裂均慢于雙親自繁組合。

圖1 細(xì)胞期雜交和自繁組合胚胎速度比較和高斯模型擬合Fig.1 Comparison of development speed of embryos from hybrid and pure crosses at cell stage and Gaussian fitting

以胚胎卵裂次數(shù)為橫坐標(biāo)、授精時(shí)間為縱坐標(biāo),將各細(xì)胞期的時(shí)間數(shù)據(jù)作點(diǎn)狀圖,直線擬合(Y=A+BX),其中系數(shù)B為每次有絲分裂所需時(shí)間(τ0)。自繁組合 SS 和 JJ的τ0分別為 21.7 min±2.9 min和 27.0 min±2.6 min,雜交組合 SJ和JS的τ0分別為22.2 min±4.7 min 和 31.3 min±6.1min(圖2,表1)。各交配組合按τ0從小到大排列為 SS、SJ、JJ、JS。可見,雜交組合有絲分裂速度均接近于母本,但略慢于母本。

雜交組合的孵化速度慢于母本,按孵化速度排列交配組合為SS、SJ、JJ、JS,孵化時(shí)間分別為563.4 min±33.8 min、632.7 min±89.5 min、711.8 min±40.0 min和 874.3 min±94.6 min(圖3,表1)。從 2細(xì)胞開始到卵裂,SS、SJ、JJ和 JS組的胚胎歷時(shí)相當(dāng)于23.9τ0、25.4τ0、24.1τ0和 24.8τ0(表1)。

圖2 線性擬合估測雜交和自繁組合的卵裂間隔Fig.2 Liner fitting to estimate the mitotic interval of the offspring from the hybrid and the pure crosses

圖3 雜色鮑與盤鮑雜交及自繁后代的孵化速度Fig.3 The hatching-out speed of offspring from the hybrid and the pure crosses

表1 雜色鮑與盤鮑正反交F1及其親本自繁2細(xì)胞期時(shí)間、孵化時(shí)間和卵裂間隔時(shí)間(水溫：22～23 ℃)Tab.1 The time of two-cell stage and hatching-out of hybrid between Haliotis diversicolor and H.disucs discus and their parents

2.2 成活率

與母本自繁組合SS相比,SJ雜交幼體成活率很低(圖4)。在擔(dān)輪幼體期和早期面盤期,SJ幼體與SS幼體在形態(tài)上沒有明顯區(qū)別。在授精后第4天,幼體開始附著,這些附著幼體畸形率很高,主要表現(xiàn)為頭部歪向一側(cè),足部不定形(圖5)。授精后第5天(匍匐幼體),SJ幼體開始大量死亡,D4、D5、D6成活率分別相當(dāng)于對照組的93.3 %、25.6 %、3.05 %、0.8 %。在授精后第9日幼體開始變態(tài),變態(tài)后,SJ的成活率為0.4%±0.03 %,SS的成活率為33.7%±5.9 %。SJ的成活率僅為SS的1.2 %。

圖4 雜色鮑♀×盤鮑♂(SJ)雜交幼體及其雜色鮑自繁幼體(SS)成活率Fig.4 Survival rates of the larvae from heterospecific cross between Haliotis diversicolor and H.discus discus(SJ),and the larvae from the pure cross of H.diversicolor(SS)

3 討論

3.1 發(fā)育速度

圖5 正常的雜色鮑自繁晚期面盤幼體(A)與畸形的雜色鮑×盤鮑雜交晚期面盤幼體(B)的形態(tài)Fig.5 The morphology of normal later veliger from the pure cross of Haliotis diversicolor (A) and the malformed later veliger from the heterospecific cross between Haliotis diversicolor× H.discus discus (B)

在計(jì)算卵裂時(shí)間、孵化時(shí)間時(shí),通常采用 50%個(gè)體發(fā)育到觀測指標(biāo)的時(shí)間。本研究中,由于雜交組合發(fā)育率較低,僅在 5%左右,故實(shí)際操作中,很難確定50%個(gè)體發(fā)育到觀測指標(biāo)的時(shí)間。另一方面,雜色鮑和盤鮑自繁與雜交胚胎卵裂速度較快,很難同時(shí)比較觀測卵裂時(shí)間。因此,在細(xì)胞期階段,本研究采用連續(xù)間隔取樣的方法,測定授精后不同時(shí)間點(diǎn)發(fā)育到特定階段的胚胎數(shù)目,以高斯模型擬合來測定處于不同細(xì)胞期時(shí)間的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。雖然這里的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差不是 50%個(gè)體發(fā)育到觀測指標(biāo)的時(shí)間,但能夠反映出不同交配組合胚胎發(fā)育至 2細(xì)胞、4細(xì)胞、8細(xì)胞和 16細(xì)胞等時(shí)期的速度和同步性。觀察孵化速度時(shí),操作時(shí)間比較充裕,可以事先將發(fā)育卵篩選出來進(jìn)行觀察。用Sigmoidal擬合工具擬合后,可以估算出50%胚胎孵化的時(shí)間。

在相同條件下,雜交親本雜色鮑和盤鮑的卵裂周期耗時(shí)不同,雜色鮑的一個(gè)卵裂周期比盤鮑耗時(shí)短約5.3 min。雜交F1胚胎發(fā)育同時(shí)含有雜色鮑與盤鮑的基因組[9],本研究結(jié)果表明,雜交 F1的卵裂周期表現(xiàn)出較強(qiáng)的母本效應(yīng)。早期發(fā)育速度的母本效應(yīng)也見于其他貝類雜交組合,例如大平洋牡蠣Crassostrea gigas與大連灣牡蠣Ostrea talienwhamensis雜交幼體生長速度居于雙親之間與母本接近[10],太平洋牡蠣與葡萄牙牡蠣C.angulata雜交F1生長速度與母本自繁對照組接近[11]。雜交F1發(fā)育早期細(xì)胞周期表現(xiàn)出母本效應(yīng)可能是由于早期胚胎發(fā)育父本基因處于關(guān)閉狀態(tài),細(xì)胞分裂所需的 RNA和蛋白質(zhì)是由卵子中貯存物提供。另一方面,SJ和JS雜交F1的有絲分裂周期雖然表現(xiàn)出較強(qiáng)的母本效應(yīng),但略慢于母本,導(dǎo)致最終孵化速度明顯慢于母本。這可能是由于雜交 F1中含有兩個(gè)細(xì)胞周期不一致的基因組,來源于父本的基因組對細(xì)胞周期調(diào)控產(chǎn)生了影響。異源基因組對細(xì)胞周期調(diào)控的影響機(jī)制有待進(jìn)一步研究。另外,正反交 F1第一次卵裂速度比雙親都慢。Que等[12]在研究太平洋牡蠣與近江牡蠣C.ariakensis雜交時(shí),也觀察到雜交胚胎第一次卵裂滯后的現(xiàn)象,并用細(xì)胞學(xué)研究結(jié)果進(jìn)一步證明雜交F1減數(shù)分裂耗時(shí)約為親本自繁的 3倍。這些結(jié)果揭示,在發(fā)育早期雜色鮑和盤鮑雜交 F1特殊的基因組結(jié)構(gòu)影響減數(shù)分裂進(jìn)程和細(xì)胞周期調(diào)控,雜交 F1具有作為減數(shù)分裂和細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制研究模型的潛在價(jià)值。

3.2 成活率

雜色鮑×盤鮑雜交 F1在幼體期出現(xiàn)高死亡率,變態(tài)后成活率僅為母本自繁的1.2 %。早期發(fā)育階段成活率低的現(xiàn)象同樣見于其他貝類和魚類遠(yuǎn)緣雜交。魏貽堯等[6]研究合浦珠母貝Pinctada martensii、長耳珠母貝P.chemnitzi和大珠母貝P.chemnitzi之間的雜交時(shí),12次雜交試驗(yàn)中僅有5次獲得極少量貝苗,收苗率只為0.01%～0.04%。草魚Ctenopharyngodon idellus與鯉Cyprinus carpio雜交F1出苗率僅為十萬分之一[13]。也有些雜交后代甚至無法活過幼體階段,如美洲牡蠣C.virginica×近江牡蠣和美洲牡蠣×太平洋牡蠣雜交 F1后代成活率低是雜交不親和的體現(xiàn)。雜交不親和在細(xì)胞和分子水平的表現(xiàn)包括：核質(zhì)不相容、染色體數(shù)目配對和分離紊亂、酶的基因位點(diǎn)或表達(dá)的時(shí)空順序不同等[14]。雜交不親和的程度大體上與親本的遺傳差異正相關(guān)[15]。雖然成活率低下,仍然有少量的雜交鮑苗存活至性成熟。作者[2]已應(yīng)用AFLP對存活的SJ 雜交F1進(jìn)行遺傳分析,結(jié)果表明存活的雜交 F1不是真正的雜種,而是含有少量父母基因的雌核發(fā)育二倍體。遠(yuǎn)緣雜交可能培育異源多倍體、異附加系、易位系等寶貴的遺傳學(xué)材料。早期成活率的觀察記錄可以指導(dǎo)進(jìn)一步研究雜種中異源染色體組的相互作用,例如在快速死亡期可以加密取樣點(diǎn),便于在DNA水平、RNA水平和細(xì)胞水平研究雜交胚胎的變化,以研究染色體行為、異源基因組互作和核質(zhì)互作。

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