(蘇州大學(xué) 醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院,蘇州大學(xué) 水產(chǎn)研究所,江蘇 蘇州 215123)

烏蘇里擬 (Pseudobagrus ussuriensis)曾用名烏蘇里,俗稱牛尾巴,隸屬于硬骨魚綱(Dsteichthyes)、輔鰭亞綱(Actinopteri)、鲇形目(Silurformes)、科(Bagridae)、擬 屬(Pseudobagrus)。因其雜食性、生長(zhǎng)快、肉質(zhì)鮮等特點(diǎn),成為優(yōu)良的養(yǎng)殖品種[1]。同其他許多魚類一樣,烏蘇里擬 的養(yǎng)殖群體是依靠采捕野生親魚進(jìn)行大量繁殖而來的,隨著人工繁殖技術(shù)的突破以及天然野生親魚群體數(shù)量的嚴(yán)重不足,難免會(huì)導(dǎo)致近親繁殖的發(fā)生。多代烏蘇里擬 自交養(yǎng)殖群體可能會(huì)產(chǎn)生基因庫萎縮和經(jīng)濟(jì)性狀衰退等問題,這將嚴(yán)重影響烏蘇里擬 種質(zhì)資源保護(hù)及其養(yǎng)殖業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。目前,有關(guān)于烏蘇里擬 的研究主要集中在人工繁育、生化遺傳學(xué)等領(lǐng)域[2-4],至于其分子方面的研究尚未見到報(bào)道。相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(sequence-related amplified polymorphism,SRAP)具有簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、中等產(chǎn)率和容易得到選擇條帶序列等優(yōu)點(diǎn)[5-6],已越來越多地被應(yīng)用于植物和動(dòng)物包括魚類基因組的分析中[7-9]。本文在確定該技術(shù)對(duì)烏蘇里擬 遺傳多樣性分析適用性的基礎(chǔ)上,通過比較烏蘇里擬 野生群體和人工養(yǎng)殖群體間的遺傳結(jié)構(gòu)差異,首次從分子水平探討烏蘇里擬 遺傳多樣性的變化,為制定烏蘇里擬 的種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)提供基礎(chǔ)資料,也為該魚人工養(yǎng)殖群體的遺傳結(jié)構(gòu)是否產(chǎn)生遺傳變異提供理論依據(jù)。從而為其珍貴的野生資源的可持續(xù)地利用以及養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供保障。

1 材料與方法

1.1 材料

烏蘇里擬 野生群體采自江蘇省洪澤湖(HL,32尾);淮安市水產(chǎn)研究所的人工繁殖群體(HA,34尾,F2代)為2006年人工繁殖的烏蘇里擬 ,其親本(F1代)是 2000年由洪澤湖捕獲的野生成魚繁殖而來的;蘇州市東山水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)的人工繁殖群體(SZ,31尾,F3代) 為 2009年人工繁殖的烏蘇里擬 ,其親本(F2代)是2006年底從淮安市水產(chǎn)研究所購(gòu)進(jìn)的1萬尾烏蘇里擬 夏花培育而成的。本實(shí)驗(yàn)從以上 3個(gè)群體中隨機(jī)取樣的情況見表1。

表1 3個(gè)烏蘇里擬鲿群體的樣本量、體長(zhǎng)及體質(zhì)量范圍Tab.1 Amount of samples,body lengths,and body weights of Pseudobagrus ussuriensis

1.2 基因組DNA的提取

剪取鰭條0.1 g,加200 μLSTE緩沖液(10 mmol/L Tris-Cl,10 mmol/L NaCl,1 mmol/L EDTA),20μLSDS,5μL蛋白酶K(20 g/L),于55℃下消化過夜,之后用酚-氯仿抽提和乙醇沉淀的方法提取其基因組DNA,經(jīng) l%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),分光光度法定量分析,將DNA稀釋至0.05 g／L。

1.3 SRAP引物

參照文獻(xiàn)[10]和文獻(xiàn)[11]設(shè)計(jì)引物,引物由上海生物工程公司合成,其序列見表2。上下有交叉組合得到100對(duì)引物。Taq酶、dNTP、DNA Maker等均為上海生工產(chǎn)品。

表2 SRAP引物Tab.2 Primers and sequences of SRAP

1.4 SRAP-PCR反應(yīng)及電泳檢測(cè)

PCR反應(yīng)總體積為25 μL,包括PCR Buffer 2.5μL,Mg2+2 μL,dNTPs 0.2 mmol/L,DNA 模板(0.05 g／L)1 μL,1.0 μmol/L 引物 1 μL,Taq 酶 1.0 U。反應(yīng)的程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min,94℃變性1 min,35℃退火1 min,72℃延伸2 min,5個(gè)循環(huán);94℃變性1 min,53℃退火1min,72℃延伸2 min,35個(gè)循環(huán);72℃下延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,銀染法染色,數(shù)碼相機(jī)拍攝保存。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用Gel-Pro analyzer對(duì)顯色后的SRAP電泳圖譜進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,每一條帶視為一個(gè)位點(diǎn),有帶記為“1”,無帶記為“0”。轉(zhuǎn)換成數(shù)字矩陣再進(jìn)行分析,選擇基因頻率作為比較指標(biāo),用 PopGene軟件進(jìn)行分析,并統(tǒng)計(jì)相應(yīng)的數(shù)據(jù)。相關(guān)計(jì)算公式如下：

(1) 群體多態(tài)位點(diǎn)Pi=該群體的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)/位點(diǎn)總數(shù)×100%

(2) 隱性等位基因a的基因頻率q是根據(jù)群體中隱性純合個(gè)體(即對(duì)應(yīng)某一擴(kuò)增位點(diǎn),不出現(xiàn)該擴(kuò)增帶的個(gè)體) 頻率的平方根計(jì)算而來,對(duì)應(yīng)的顯性等位基因A 的基因頻率p= 1-q,文中提到的基因頻率均為每位點(diǎn)顯性等位基因的基因頻率。

(3) 遺傳相似系數(shù)Sij=Nij/ (Ni+Nj+Nij)[12]

其中,Sij為任意兩個(gè)個(gè)體間的遺傳相似系數(shù),Nij為i個(gè)體和j個(gè)體共享位點(diǎn)數(shù),Ni、Nj分別為i個(gè)體和j個(gè)體各自擴(kuò)增的位點(diǎn)總數(shù)。群體間的遺傳相似系數(shù)為兩群體任意兩個(gè)體遺傳相似系數(shù)的平均數(shù)。Sij為兩群體間的遺傳相似系數(shù);Si、Sj分別表示群體i和群體j的遺傳相似系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SRAP擴(kuò)增結(jié)果

圖1 部分引物對(duì)烏蘇里擬 3個(gè)群體的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification in the three populatins

用篩選出的12對(duì)SRAP引物組合對(duì)3個(gè)烏蘇里擬 群體共擴(kuò)增出202個(gè)清晰穩(wěn)定的位點(diǎn)(圖1),每組引物對(duì)烏蘇里擬 3群體擴(kuò)增均產(chǎn)生 11～17個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn),片段大小在 572～111bp,其中多態(tài)位點(diǎn)有130個(gè),多態(tài)位點(diǎn)比例為64.36%。對(duì)各引物組合擴(kuò)增的位點(diǎn)總數(shù)及多態(tài)位點(diǎn)比例的統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同引物組合在 3個(gè)群體中的擴(kuò)增位點(diǎn)總數(shù)和多態(tài)位點(diǎn)數(shù)均有顯著差異(表3)。但是,除 F8R8引物組合中,野生群體的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)少于兩個(gè)養(yǎng)殖群體的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)外,其他各引物組合在野生群體中所擴(kuò)增出的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)均多于2個(gè)養(yǎng)殖群體,野生HL群體的多態(tài)位點(diǎn)率為 63.13%,養(yǎng)殖 HA群體的多態(tài)位點(diǎn)率為56.54%,而養(yǎng)殖SZ群體的多態(tài)位點(diǎn)率為54.88%。

表3 3個(gè)群體擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)及多態(tài)位點(diǎn)比例Tab.3 Number of ampliphied loci and the percentages of polymorphic loci in the three populations

2.2 三個(gè)群體擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)在不同顯性基因型頻率的分布

參照張志偉等[14]和張全啟等[15]的方法,將 202個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)的顯性基因型頻率以 10%為單位劃分區(qū)間,0和 100%分別設(shè)為單獨(dú)的區(qū)間,這樣共劃分為12個(gè)區(qū)間,統(tǒng)計(jì)顯性基因型頻率在各區(qū)間內(nèi)的位點(diǎn)數(shù)。結(jié)果表明,3個(gè)群體在不同顯性頻率區(qū)間內(nèi)的擴(kuò)增為點(diǎn)數(shù)呈現(xiàn)一定的分布規(guī)律,反映了 3個(gè)群體的遺傳結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。2個(gè)養(yǎng)殖群體在不同區(qū)間內(nèi)的分布規(guī)律基本相同,在 100%區(qū)間位點(diǎn)數(shù)較多,其他區(qū)間位點(diǎn)數(shù)則相對(duì)較少,在不同區(qū)間位點(diǎn)數(shù)的變化規(guī)律則基本一致,這表明兩個(gè)養(yǎng)殖群體的遺傳結(jié)構(gòu)非常相近;與野生群體的比較顯示,在 1%～9%區(qū)間內(nèi)野生群體的多態(tài)位點(diǎn)顯著多于兩個(gè)養(yǎng)殖群體,位點(diǎn)數(shù)分別為野生群體53個(gè)、養(yǎng)殖群體21個(gè)、養(yǎng)殖群體24個(gè),在100%區(qū)間野生群體位點(diǎn)數(shù)顯著少于養(yǎng)殖群體,其他區(qū)間野生群體與養(yǎng)殖群體的位點(diǎn)數(shù)分布規(guī)律則無顯著差異(圖2)。這表明養(yǎng)殖群體中的隱形純合位點(diǎn)明顯高于野生群體,養(yǎng)殖群體中的低頻位點(diǎn)顯著減少,養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性水平有所降低。

圖2 烏蘇里擬 3群體擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)在不同顯性基因型頻率區(qū)間內(nèi)的分布Fig.2 Distributions of amplified loci of the three populations in different frequency intervals

2.3 3個(gè)群體的遺傳多樣性指數(shù)及遺傳距離

Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)和 Shannon’s信息指數(shù)(I)是衡量群體遺傳多樣性的重要參數(shù)。Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)反映的是群體在數(shù)個(gè)基因座位上的遺傳變異,是最適合衡量群體遺傳變異的一個(gè)參數(shù),其值的大小可以反映群體遺傳變異的高低。從表4中可以看出,烏蘇里擬 野生群體的Nei’s基因多樣性指數(shù)和Shannon’s信息指數(shù)(I)更高,兩個(gè)養(yǎng)殖群體的Nei’s基因多樣性指數(shù)和 Shannon’s信息指數(shù)(I)則相對(duì)較低,這表明野生群體的遺傳多樣性水平高于養(yǎng)殖群體。從表5中可以看出,HL野生群體與HA養(yǎng)殖群體間的遺傳距離最大為 0.1730,兩個(gè)養(yǎng)殖群體間的遺傳距離最小為0.1087,HL野生群體與SZ養(yǎng)殖群體間的遺傳距離居中。這表明養(yǎng)殖群體存在較為嚴(yán)重的遺傳分化,且遺傳多樣性水平降低。

表4 烏蘇里擬鲿3群體的遺傳多樣性指數(shù)Tab.4 Genetic diversity indices of each population

表5 烏蘇里擬鲿3群體的遺傳相似系數(shù)及群體間的遺傳距離Tab.5 Intra-population genetic similarity and relative genetic distances among three populations

3 討論

3.1 SRAP在烏蘇里擬 遺傳多樣性研究中的適用性

SRAP呈顯性標(biāo)記,一條帶代表一等位基因[16]。其主要是利用獨(dú)特的引物設(shè)計(jì),對(duì)開放式閱讀框架進(jìn)行擴(kuò)增。正向引物長(zhǎng) 17bp,5′端的前10bp是一段填充序列,緊接著是 CCGG,它們組成核心序列,核心序列及3′端的3個(gè)選擇性堿基,能對(duì)外顯子進(jìn)行特異擴(kuò)增。反向引物長(zhǎng)18bp,5′端的前10-1lbp是一段填充序列,緊接著是 AATT,它們組成核心序列,在3′端3個(gè)選擇堿基的協(xié)同作用下,對(duì)內(nèi)含子區(qū)域、啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行特異性擴(kuò)增[17]。SRAP由于其獨(dú)特的引物設(shè)計(jì)原則以及其成本低、重復(fù)性強(qiáng)、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn),已廣泛應(yīng)用于作物及水產(chǎn)動(dòng)物種質(zhì)資源方面的研究[18-20]。鄭翠芳等[21]采用 153對(duì)引物對(duì)愛玉子的性別及品系進(jìn)行了研究,得到一 200bp的特異條帶將雌雄株分開,并用8對(duì)引物對(duì)24個(gè)雌性品系和16個(gè)雄性品系進(jìn)行比較擴(kuò)增,顯示較高的多態(tài)性。張志偉等[14]采用88對(duì)引物對(duì)草魚的3個(gè)群體進(jìn)行SRAP分析,結(jié)果表明草魚人工繁殖群體的遺傳多樣性水平有所下降。辛文婷[22]采用 100對(duì)引物構(gòu)建了基于SRAP分子標(biāo)記的黃顙魚遺傳圖譜。傅洪拓等[23]采用SRAP分子標(biāo)記對(duì)海南沼蝦的5個(gè)中群體進(jìn)行遺傳多樣性分析,為海南沼蝦的種質(zhì)資源保護(hù)和利用提供了理論依據(jù)。本研究構(gòu)建了適用于烏蘇里擬 分子標(biāo)記的 SRAP反應(yīng)體系,并篩選出合適的引物組合,對(duì)烏蘇里擬 1個(gè)野生群體和2個(gè)人工養(yǎng)殖群體的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較研究,表明 SRAP分子標(biāo)記同樣適用于烏蘇里擬 遺傳多樣性的分析。

3.2 魚類野生群體與人工養(yǎng)殖群體間的遺傳多樣性分析

作者采用穩(wěn)定性強(qiáng)、產(chǎn)率高的 SRAP分子標(biāo)記首次對(duì)烏蘇里擬 1個(gè)野生群體和2個(gè)人工養(yǎng)殖群體的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較,3個(gè)群體(HL群體、HA群體、SZ群體)的多態(tài)位點(diǎn)比例分別為63.13%、56.54%、54.88%;Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)為 0.2641、0.2546、0.2469;Shannon’s 信息指數(shù)(I)為 0.4118、0.4050、0.3861。與野生群體相比,2個(gè)養(yǎng)殖群體的多態(tài)位點(diǎn)比例、Nei’s 基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon’s 信息指數(shù)(I)有著不同程度的下降,這說明養(yǎng)殖群體遺傳多樣性水平較低,且存在較為明顯的遺傳分化趨勢(shì)。不同學(xué)者在其他物種的研究中同樣發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象,如：張志偉等[14]采用 SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)草魚野生群體和人工繁殖群體遺傳結(jié)構(gòu)的比較研究發(fā)現(xiàn)：草魚養(yǎng)殖群體期望雜合度平均值顯著低于野生群體,部分等位基因丟失,推測(cè)主要是親本數(shù)量少以及養(yǎng)殖環(huán)境發(fā)生改變,使得養(yǎng)殖群體出現(xiàn)中指上的同質(zhì)化,致使部分等位基因丟失;張全啟等[15]采用 AFLP分子標(biāo)記技術(shù)在對(duì)牙鲆野生群體和養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性分析時(shí)不僅檢測(cè)到養(yǎng)殖群體的遺傳雜合度降低,還檢測(cè)到由于低頻位點(diǎn)的丟失造成總數(shù)目位點(diǎn)的減少,推測(cè)可能是由于在人工繁殖過程中一些不合理的因素(如繁殖親魚數(shù)量少、遺傳漂變等)造成的。潘偉志等[4]采用聚丙烯酰胺凝膠電泳方法對(duì)黑龍江水系烏蘇里擬 心、肝、腎、眼、肌肉和性腺共 6種組織進(jìn)行了 9種同工酶生化遺傳學(xué)分析,結(jié)果表明,烏蘇里擬 EST、GDH、IDH、POD同工酶譜中存在不同程度的組織特異性,EST表現(xiàn)出明顯的性別差異性。他們還通過電泳酶譜帶命名和遺傳學(xué)參數(shù)計(jì)算的方法,共記錄了 19個(gè)基因位點(diǎn),多態(tài)位點(diǎn)百分?jǐn)?shù)P=21.05%,種群遺傳偏離指數(shù)d=-1,該烏蘇里擬 種群內(nèi)部雜合子缺失較嚴(yán)重,偏離 Hardy-Weinberg平衡,養(yǎng)殖群體遺傳多樣性較低,這也與本文的研究結(jié)果相吻合。潘偉志等[3]對(duì)烏蘇里擬 繁殖生物學(xué)的研究結(jié)果表明,體長(zhǎng) 225～468mm 個(gè)體的絕對(duì)懷卵數(shù)為(2684±1029)粒,發(fā)現(xiàn)比野生群體自然繁殖期中的懷卵數(shù)量少,這可能與養(yǎng)殖群體遺傳結(jié)構(gòu)的改變有關(guān)。我們對(duì)F3代進(jìn)行人工繁殖時(shí)也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象,是由于養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性降低還是環(huán)境和養(yǎng)殖條件等因素改變導(dǎo)致的繁殖力下降,有待于進(jìn)一步研究。

本研究采用 SRAP分子標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)到養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性有所降低,還發(fā)現(xiàn)在養(yǎng)殖群體中低頻位點(diǎn)顯著減少,而隱性純合基因顯著增加。推測(cè)其原因,可能是養(yǎng)殖群體的親本數(shù)量比較少,尤其在人工繁殖時(shí)由于雄魚個(gè)體遠(yuǎn)大于雌性個(gè)體,常常出現(xiàn)雌雄親魚數(shù)量比例過高的現(xiàn)象,導(dǎo)致人工養(yǎng)殖群體遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,遺傳漂變的結(jié)果使得后代中一些稀有位點(diǎn)丟失、低頻位點(diǎn)顯著減少,而隱性純合基因顯著增加。但從遺傳距離及遺傳分化的角度分析,人工養(yǎng)殖群體還沒有形成獨(dú)立的遺傳結(jié)構(gòu)。因此,在未來烏蘇里擬 的保種或人工繁殖和養(yǎng)殖工作中,應(yīng)該注意親本的更新,并選用足夠大的、有代表性的親本群體,尤其在人工繁殖時(shí)要保證雄性親魚的使用量,從而在保持優(yōu)良性狀的同時(shí)最大限度的保留群體的遺傳多樣性,以促進(jìn)烏蘇里擬 種質(zhì)資源保護(hù)和養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

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