辛 一

(1.中國科學(xué)院 海洋研究所,山東 青島266071; 2.中國科學(xué)院 研究生院,北京100049)

鮑(Haliotis)是一種藻食性海洋動物,有 7個種分布于中國沿海[1],其中皺紋盤鮑(H.discus hannai)和雜色鮑(H.diversicolor)等都是重要的養(yǎng)殖貝類[2]。中國北方普遍養(yǎng)殖的皺紋盤鮑和原產(chǎn)于日本的盤鮑(H.discus discus)在形態(tài)和生態(tài)上非常相似,對它們的分類地位尚存在不同意見[3-4]; 此外,原產(chǎn)于中國臺灣的九孔鮑(H.diversicolor supertexta)與南方沿海的雜色鮑(H.diversicolor diversicolor)在外部形態(tài)和生長特性方面雖存在一定差別,但對于是否將二者劃分為亞種仍有爭議[1,5]。

線粒體DNA作為一種常用的分子標(biāo)記,已在軟體動物的系統(tǒng)發(fā)生、物種鑒定和種群結(jié)構(gòu)等研究中得到廣泛應(yīng)用[6-7]。線粒體COI基因中的部分區(qū)域由于其變異速率適中及具有完善的通用引物,常被用作物種鑒定的DNA條形碼[8]。盡管基于線粒體基因的分子標(biāo)記在鮑屬物種鑒定中的應(yīng)用已有報道[9-11],但對于線粒體基因組中COI、CYTB等基因在鮑屬物種鑒定中的適用程度,仍然缺乏深入了解。

為尋找更適于鮑屬物種鑒定的線粒體基因,并補(bǔ)充中國鮑屬物種的線粒體基因相關(guān)信息,本研究報道了中國及日本沿海5個皺紋盤鮑群體共16個個體的線粒體基因COI、COII以及CYTB的完整序列,并結(jié)合雜色鮑、疣鮑(H.tuberculata)和黑唇鮑(H.rubra)的線粒體基因組信息,對上述各基因在鮑屬種內(nèi)和種間序列特征的異同進(jìn)行了比較,以分析COI、COII以及CYTB作為鮑屬DNA條形碼的適用性,為基于線粒體基因的分子標(biāo)記在鮑屬物種鑒定中的進(jìn)一步應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣本采集

選取中國大連、青島、威海、汕頭以及日本宮城5個皺紋盤鮑群體共16個個體,每個群體至少取2個個體,包含在至少 2個取樣點(diǎn)中。所有樣本在－80℃下冷凍保存,或固定保存于 70%～80%酒精中。所有樣本的采集地、樣本編號、GenBank序列號等詳細(xì)信息見表1,其中3個雜色鮑的線粒體基因組數(shù)據(jù)已在之前的相關(guān)工作中獲得(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。

1.2 DNA片段的擴(kuò)增與測序

采用 Sambrook等[12]介紹的苯酚氯仿法抽提樣本DNA。根據(jù)GenBank中皺紋盤鮑線粒體DNA序列(EU595789),設(shè)計以下引物用于片段擴(kuò)增：COI：Hdis-COI-F (5′-TACCGAGGACTCACAATA-3′)和Hdis-COI-R (5′-CTTATCTTCTTCCACGACCA-3′);COII：Hdis-COII-F (5′-TGGGATGGATGTAGACAC TCGTGCTTAT-3′)和 Hdis-COII-R(5′-AGCATTATTCACCTCCCT-3′);CYTB：Hdis-CYTB-F(5′-AACATCC CAGAAGAACAC-3′)和 Hdis-CYTB-R(5′-CCCACTACCATCACCAAA-3′)。反應(yīng)條件如下：起始 94℃預(yù)變性3 min,然后94℃變性30 s,48～60℃退火50 s,72℃延伸1～4 min,35個循環(huán)。最后72℃反應(yīng)10 min。反應(yīng)體系 25 μL,包括 2 μL dNTP (10mmol/L),正反向引物各 1μL(10 μmol/L),2.5 μL 10×buffer(Mg2+plus),0.4 μL rTaq 酶(5U/μL,Takara),1 μL DNA 模板(50 ng/μL),以及超純水 17.1 μL。PCR 產(chǎn)物采用博日柱式膠回收試劑盒純化,利用ABI 3730xl測序儀測序,每個堿基至少達(dá)到2倍的測序覆蓋度。

表1 樣品名錄及序列信息Tab.1 Sample information

1.3 數(shù)據(jù)分析

原始測序峰圖文件首先利用軟件Phred處理,使每個堿基的質(zhì)量值在20以上,然后在默認(rèn)參數(shù)下用軟件Phrap拼接[13-14],拼接結(jié)果和序列堿基質(zhì)量通過Consed軟件檢查[15]。使用 MEGA4.1[16]內(nèi)置的clustalW 進(jìn)行序列比對(alignment)和堿基組成,計算基于 Kimura雙參數(shù)距離模型(K2P)[17]的種內(nèi)和種間遺傳距離。采用DnaSP 4.10.7分析種間及種內(nèi)的序列多態(tài)性[18]。4種鮑非同義替代率(non-synonymous substitutions,Ka)和同義替代率(synonymous substitutions,Ks) 比率的計算使用KaKs_Calculator[19]。

2 結(jié)果與討論

2.1 基因特征

COI、COII和CYTB全序列的長度在鮑屬4個物種間相同,分別為 1,542 bp、696 bp 和 1,140 bp。COI、COII和CYTB的G+C平均含量為38.2%～45.2%,低于 A+T的平均含量 54.8%～61.8%,密碼子第二位的G+C含量在個體間的波動范圍最小,其均值與第三位基本接近,而密碼子第一位的 G+C含量波動范圍最大,且均值明顯偏高。此外通過計算發(fā)現(xiàn),COI、COII和CYTB的Ka/Ks均值依次為0.010、0.021和0.033,說明 3種基因都承受強(qiáng)烈的負(fù)選擇壓力,其中COI所承受的負(fù)選擇壓力最大,表明COI是上述3種基因中最保守的基因。

2.2 遺傳距離比較

本研究的4種鮑COI、COII和CYTB的種內(nèi)最大遺傳距離依次為 8.8%、10.4%和 9.5%,若去除種內(nèi)亞種間遺傳距離的影響,則種內(nèi)最大遺傳距離依次為1.3%、1.2%和1.7%,而種間最小遺傳距離依次為16.4%、16.1%和17.7%。如圖1所示,COI、COII和CYTB的種間遺傳距離和種內(nèi)遺傳距離具有顯著差異,根據(jù)計算,COI、COII和CYTB的種間遺傳距離均值與種內(nèi)遺傳距離均值之比依次為 25.6、23.9和 21.5。Hebert等認(rèn)為種內(nèi)與種間的標(biāo)準(zhǔn)差異閾值(standard divergence threshold value)應(yīng)為種內(nèi)平均遺傳距離的10倍(10倍法則)[20]。按照這個標(biāo)準(zhǔn),由于本研究中上述 3種基因的鮑屬條形碼差異閾值應(yīng)分別為6.5%、6.1%和8.9%,而鮑屬種內(nèi)遺傳差異最大值分別為1.3%、1.2%和1.7%,屬內(nèi)不同種間遺傳差異最小值分別為 16.4%、16.1%和 17.7%,因此利用基于COI、COII和CYTB的分子標(biāo)記能夠?qū)⒈狙芯可婕暗孽U屬種類全部有效區(qū)分開,證實(shí)了本研究所選用的鮑屬物種存在種間的條形碼間隙。

圖1 鮑屬種間和種內(nèi)個體間COI、COII和CYTB遺傳距離(基于K2P)分布情況Fig.1 Distribution of intraspecific and interspecific K2P distance based on COI,COII and CYTB of Haliotis

2.3 基因序列多態(tài)性分析

比較分析了基于COI、COII和CYTB序列的鮑屬種間及種內(nèi)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)。如圖2所示,4種鮑的種間與種內(nèi)單核苷酸多態(tài)性形成明顯分界。鮑屬COI、COII和CYTB的序列多態(tài)性水平表明,雖然上述3種基因的全序列都可用于區(qū)分鮑屬物種,但用基因不同區(qū)域進(jìn)行鮑屬物種鑒定時,其有效性存在差異。首先,圖2中的基因區(qū)域V1、V2、V4和V6在種內(nèi)和種間的單核苷酸多態(tài)性較其他區(qū)域更加豐富,因此這些區(qū)域可能更適用于區(qū)別鮑屬種內(nèi)和種間的序列差異;其次,COII中的高變區(qū)V3和CYTB中的高變區(qū)V5在疣鮑亞種內(nèi)的單核苷酸多態(tài)性水平明顯高于相應(yīng)區(qū)域內(nèi)皺紋盤鮑和雜色鮑的地理群體間水平,說明在進(jìn)行鮑屬亞種鑒定時,COII和CYTB中可能存在比COI通用區(qū)域更為有效的DNA條形碼,從而為鮑的亞種鑒定提供了新的 DNA條形碼參考序列; 最后,皺紋盤鮑不同群體的序列多態(tài)性水平雖在COI和CYTB的部分區(qū)域中相對較高,但由于各群體的取樣個數(shù)未達(dá)到有效的統(tǒng)計學(xué)標(biāo)準(zhǔn),因此無法對皺紋盤鮑群體之間的遺傳多樣性進(jìn)行深入調(diào)查。為了開發(fā)出可靠的皺紋盤鮑群體間DNA條形碼,需要在今后的工作中增加皺紋盤鮑各群體的樣本數(shù),以及擴(kuò)大對線粒體基因組的探測范圍等。

在本研究中,遺傳距離和序列多態(tài)性的結(jié)果表明COI、COII和CYTB都可用于區(qū)分鮑屬物種。鑒于目前GenBank中鮑屬COI的發(fā)表序列較COII和CYTB更多,且COI具有完善的通用引物,可以更加方便高效地進(jìn)行研究,本研究建議采用COI序列作為目前鮑屬物種鑒定的DNA條形碼。

致謝：本研究所用樣本、試劑、測序等一切費(fèi)用均由劉曉研究員提供,在實(shí)驗(yàn)設(shè)計、數(shù)據(jù)分析和論文撰寫全過程中都得到了劉曉研究員的大力支持與悉心指導(dǎo),在此表示衷心感謝！任建峰博士參加了部分序列分析工作,謹(jǐn)此致謝！

圖2 基于COI、COII和CYTB序列的鮑屬不同種內(nèi)及種間核苷酸多態(tài)性比較圖Fig.2 Comparison of intraspecific and interspecific of nucleotide diversity based on COI,COII and CYTB sequences of Haliotis.

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