汪靖超,辛宜軒

(1.青島大學(xué) 生物系,山東 青島 266071; 2.青島第二中學(xué),山東 青島 266061)

滸苔(Enteromopha prolifera(Müller) J.Ag.)是一種大型經(jīng)濟(jì)海藻,屬綠藻門(mén)、石莼目、石莼科、滸苔屬,廣泛分布于河口、近海灘涂,自然繁殖能力和環(huán)境適應(yīng)能力特別強(qiáng)。適度的滸苔生長(zhǎng)會(huì)消耗水體中的營(yíng)養(yǎng)鹽和浮游生物,在一定程度上能降低赤潮的發(fā)生幾率,但滸苔等綠藻的瞬間大量爆發(fā)則會(huì)形成綠潮。綠潮現(xiàn)在已成為全世界范圍的富營(yíng)養(yǎng)化難題,法國(guó)Brittany海區(qū)綠藻大規(guī)模爆發(fā),每年打撈的綠藻可達(dá)85 000m3,日本從20世紀(jì)70年代起每年均有綠潮爆發(fā),橫濱市每年花費(fèi)在打撈綠藻上的費(fèi)用可達(dá)4 000萬(wàn)日元[1-3]。2007年7月和2008年6月,青島近海海域發(fā)生了大規(guī)模滸苔漂浮現(xiàn)象,政府和民間動(dòng)員大量人力物力,兩年分別打撈出 7000多噸和100多萬(wàn)噸滸苔[4-5]。

溶藻細(xì)菌(Algae-1ysing bacterium)能夠通過(guò)直接或間接方式,抑制藻類(lèi)生長(zhǎng)或殺死藻類(lèi),從而溶解藻細(xì)胞。在利用物理、化學(xué)以及其他方法治理水華都不太理想的情況下,溶藻細(xì)菌的使用已經(jīng)引起越來(lái)越多學(xué)者的關(guān)注[6-7]。作者從青島海域的海泥中分離純化了一株可抑制滸苔生長(zhǎng)的海洋細(xì)菌 EP23,并對(duì)該菌株進(jìn)行了鑒定,以期為滸苔的生物防治研究提供理論根據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

滸苔采自青島第一海水浴場(chǎng),海泥取自青島大麥島,實(shí)驗(yàn)用海水取自青島奧帆賽場(chǎng)。16S rDNA引物合成、DNA序列分析由上海生工生物工程技術(shù)有限公司完成,克隆所需工具酶購(gòu)自大連寶生物工程公司,其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基均用陳海水配制。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 滸苔培養(yǎng)

接種滸苔于無(wú)菌海水中,光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為 20℃,光照強(qiáng)度為 60 μmol/(m2.s),光: 暗為12 h:12 h,每天搖動(dòng)培養(yǎng)瓶3次。

1.3.2 溶藻細(xì)菌的分離

稱(chēng)取10 g海泥,放入盛有90 mL無(wú)菌海水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中,振蕩30 min。懸液稀釋后涂布牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,28℃培養(yǎng)48 h,對(duì)培養(yǎng)出的眾多細(xì)菌再劃線(xiàn)分離純化,獲得單個(gè)菌落。

1.3.3 溶藻細(xì)菌對(duì)滸苔抑制活性的測(cè)定

分別挑取分離的各菌落于2 mL LB培養(yǎng)液中,28℃振蕩培養(yǎng)24 h,10 000r/min離心5 min,取上清,按照 1 : 100的比例(V/V)加入滸苔培養(yǎng)液中,混勻,20℃繼續(xù)培養(yǎng)3 d,觀察滸苔變化。

1.3.4 菌種鑒定

1.3.4.1 菌體形態(tài)學(xué)觀察

牛肉膏蛋白胨平板劃線(xiàn)培養(yǎng)待鑒定菌株,28 ℃恒溫培養(yǎng)1~3 d,進(jìn)行形態(tài)學(xué)、革蘭氏染色、鞭毛染色和芽孢染色觀察,具體方法參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行。

1.3.4.2 生理生化特征的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[8]介紹的方法進(jìn)行。

1.3.4.3 基因組DNA的提取和16S rDNA的擴(kuò)增

參照文獻(xiàn)[9-10]的方法進(jìn)行 DNA的提取、引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增。

1.3.4.4 克隆載體的構(gòu)建、測(cè)序及分子生物學(xué)鑒定

回收PCR產(chǎn)物,連接到pMD-18T Simple載體,轉(zhuǎn)化E.coliDH5α,堿法提取質(zhì)粒,酶切后進(jìn)行電泳分析并測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果用NCBI的Blast程序進(jìn)行序列同源性比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離

從實(shí)驗(yàn)海泥中分離得到了特征明顯的57株細(xì)菌,測(cè)定各菌株對(duì)滸苔的毒性,有8株菌株對(duì)滸苔有抑制作用,其中毒性最強(qiáng)的為第23號(hào)菌株,該菌株編號(hào)為EP23。

2.2 菌株EP23的形態(tài)特征

EP23菌株在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上 28℃培養(yǎng)24 h后,形成的菌落圓形、扁平、灰白色、不透明、黏稠、大小中等、表面不光滑、邊緣不規(guī)則。草酸銨結(jié)晶紫常規(guī)染色,光鏡下觀察該菌為桿狀,單生、雙生或多個(gè)細(xì)胞連接成鏈狀,菌體大小為 0.7~0.8 μm×2.5~3.5 μm。懸滴法觀察EP23菌株具有很強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)性,硝酸銀鞭毛染色觀察到細(xì)胞有周生鞭毛;Schaeffer-Fulton氏染色法觀察到大量菌體內(nèi)有芽孢,未見(jiàn)伴孢晶體,芽孢中生,橢圓形,芽孢囊不膨大;革蘭氏染色陽(yáng)性。

2.3 生理生化特征

EP23菌株的生理生化特征見(jiàn)表1。

表1 EP23菌株的生理生化特征Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of strain EP23

綜合該菌株的菌落形態(tài)、個(gè)體特征及其生理生化反應(yīng)特性,參照文獻(xiàn)[11-12],將 EP23菌株初步鑒定為彎曲芽孢桿菌(Bacillus flexus)。

2.4 16S rDNA序列分析

由PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖(圖1)可見(jiàn),擴(kuò)增得到目的片段長(zhǎng)約 1.5 kb左右,與 16S rRNA序列長(zhǎng)度一致。將擴(kuò)增的16S rDNA序列克隆后測(cè)序得到1451 bp長(zhǎng)度的序列,該序列在 GenBank中的登錄號(hào)為GQ279347。將該序列與 GeneBank庫(kù)中已有的細(xì)菌16S rDNA序列進(jìn)行BLAST比較后,發(fā)現(xiàn)該菌株與彎曲芽孢桿菌(Bacillus flexusstrain KSC_SF9c)16S rDNA同源性高達(dá)99.7%,結(jié)合細(xì)菌的常規(guī)鑒定結(jié)果,將該菌株鑒定為枯草芽孢桿菌。

2.5 EP23對(duì)滸苔的毒性

EP23菌株經(jīng)過(guò)液體培養(yǎng)后,經(jīng)過(guò)高速離心去除絕大部分菌體,上清液按體積1 : 100的比例,加入滸苔的培養(yǎng)液,3 d后藻體開(kāi)始變黃,5 d后滸苔全部死亡,葉綠素分解,說(shuō)明 EP23的胞外產(chǎn)物對(duì)滸苔具有明顯的毒性。

圖1 EP23菌株基因組DNA的提取與16S rDNA的擴(kuò)增Fig.1 Genomic DNA and 16S rDNA of strain EP23

3 討論

目前對(duì)于滸苔的爆發(fā),除了動(dòng)用人力打撈之外,缺少有效的控制方法。雷清新等[13]研究了銅離子對(duì)緣管滸苔(E.linza)的毒性,結(jié)果顯示0.5 mg/L的Cu2+可使緣管滸苔迅速死亡。孫修濤等[14]研究了鹽度、溫度、黑暗、酸度等4個(gè)理化環(huán)境因子以及生石灰、硫酸銅、含氯消毒劑、7種除草劑對(duì)滸苔生長(zhǎng)的影響,結(jié)果顯示滸苔是一種具有極強(qiáng)抗逆能力的海洋植物,各種試驗(yàn)用藥物均需要較高的濃度才會(huì)對(duì)滸苔有毒性,而藥物的大量使用又會(huì)對(duì)海洋環(huán)境造成新的污染。

利用溶藻細(xì)菌控制水華的研究在國(guó)外已有數(shù)十年歷史,近年來(lái),不少?lài)?guó)外研究者認(rèn)為: 水華和赤潮的突然消亡可能與溶藻細(xì)菌的感染有關(guān)[7]。國(guó)內(nèi)外陸續(xù)報(bào)道了多種具有溶藻活性的細(xì)菌,Reim[15]曾報(bào)道了一株桿菌屬細(xì)菌對(duì)藍(lán)藻有溶藻活性,該細(xì)菌通過(guò)分泌胞外物質(zhì)殺死藍(lán)藻細(xì)胞。細(xì)菌的溶藻方式一般有兩種: 一是直接溶藻,也就是直接進(jìn)攻藻細(xì)胞,它需要菌體與藻細(xì)胞直接接觸,甚至侵入藻細(xì)胞內(nèi)部;二是間接溶藻,主要包括細(xì)菌同藻類(lèi)爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)或細(xì)菌分泌胞外物質(zhì)溶藻[6]。本文分離到的彎曲芽孢桿菌EP23,其培養(yǎng)液高速離心后,上清液對(duì)滸苔具有明顯毒性,表明彎曲芽孢桿菌EP23是通過(guò)分泌胞外物質(zhì)的間接方式進(jìn)行溶藻的,作者也將對(duì)該菌分泌的毒素性質(zhì)及其抑制滸苔生長(zhǎng)的機(jī)理作深入的研究。

彎曲芽孢桿菌EP23的實(shí)際應(yīng)用,還有幾個(gè)問(wèn)題需要加以解決,首先,雖然該菌本身就是從海泥中分離而來(lái),也未見(jiàn)彎曲芽孢桿菌是魚(yú)、蝦、貝等海洋生物致病菌的報(bào)道,但該菌對(duì)于廣大海洋生物是否存在毒性,施用后能否造成二次污染,還需要進(jìn)行廣泛深入的研究; 同時(shí),滸苔大爆發(fā)根本原因是水體的富營(yíng)養(yǎng)化,而細(xì)菌溶藻后水體中大量的氮、磷并未被去除,富營(yíng)養(yǎng)化問(wèn)題仍然存在,利用細(xì)菌進(jìn)行溶藻,雖然可在表面上消除滸苔爆發(fā)形成的綠潮,并不能從根本上解決水華問(wèn)題,徹底解決滸苔大爆發(fā)的問(wèn)題還應(yīng)該以預(yù)防為主,減少對(duì)海水的污染,控制海水的富營(yíng)養(yǎng)化。

[1]應(yīng)成琦,張婷,李信書(shū),等.我國(guó)近海滸苔漂浮種類(lèi)ITS與18S rDNA序列相似性分析[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2009,33(2): 215-219.

[2]Hiraoka M,Ohno M,Kawaguchi S,et al.Crossing test among floatingUlva thalliforming ‘green tide’in Japan[J].Hydrobiologia,2004,512(1): 239-245.

[3]Merceron M,Antoine V,Auby I,et al.In situ growth potential of the subtidal part of green tide formingUlvaspp.Stocks[J].The Science of the Total Environment,2007,384: 293-305.

[4]張曉雯,毛玉澤,莊志猛,等.黃海綠潮滸苔的形態(tài)學(xué)觀察及分子鑒定[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué),2008,15(5): 822-829.

[5]丁蘭平,欒日孝.滸苔(Enteromorpha prolifera)的分類(lèi)鑒定、生境習(xí)性及分布[J].海洋與湖沼,2009,40(1): 68-71.

[6]盧蘭蘭,李根保,沈銀武,等.溶藻細(xì)菌 DC-L14的分離、鑒定與溶藻特性[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2009,15(1): 106-109.

[7]吳剛,席宇,趙以軍.溶藻細(xì)菌研究的最新進(jìn)展[J].環(huán)境科學(xué)研究,2002,15(5): 43-46.

[8]沈萍,范秀容,李廣武.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].3版.北京:高等教育出版社,1999.

[9]劉進(jìn)元.分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京: 清華大學(xué)出版社,2002.

[10]閆志勇,王斌,蘇維奇,等.多重半套式 PCR 檢測(cè)細(xì)菌16s rRNA 基因方法的建立[J].青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2001,37(1): 22-24.

[11]R E 布坎南,N E 吉本斯.伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M].8版.北京: 科學(xué)出版社,1984.

[12]東秀珠,蔡妙英.常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京:科學(xué)出版社,2001.

[13]雷清新,于志剛,張經(jīng),等.銅對(duì)緣管滸苔生理狀態(tài)的影響[J].海洋環(huán)境科學(xué),1998,17(1): 11-14.

[14]孫修濤,王翔宇,汪文俊,等.綠潮中滸苔的抗逆能力和藥物滅殺效果初探[J].海洋水產(chǎn)研究,2008,29(5): 130-136.

[15]Reim R L,Shane M S,Cannon R E.The characterization of a Bacillus capable of blue-green bactericidal activity[J].Can J Microbiol,1974,20(7): 981-986.