胡 俊,柳 欣,王 磊,黃邦欽

(1.廈門大學(xué) 福建省海洋環(huán)境科學(xué)重點實驗室 海洋與環(huán)境學(xué)院,福建 廈門 361005; 2.華東師范大學(xué) 河口海岸學(xué)國家重點實驗室,上海 200062)

由于葉綠素、類胡蘿卜素等光合色素具備：(1)只有營光合作用的浮游生物細(xì)胞中含有; (2)一些光合色素僅出現(xiàn)于某一類浮游生物; (3)光合色素分子不穩(wěn)定,細(xì)胞死亡后會迅速分解; (4)不同的光合色素對可見光的吸收光譜特征不同。因此,光合色素的測定不僅可以用于指示浮游植物的總生物量,還可作為生物標(biāo)志物,用于指示浮游植物的類群組成、生理狀況[1]、水團(tuán)的特征[2,3]、真光層中的輸出生產(chǎn)力[4]、水質(zhì)狀況[5]及浮游植物原位生長速率等[6],已經(jīng)被國內(nèi)外海洋生態(tài)學(xué)家廣泛接受。隨著矩陣因子化程序CHEMTAX[7]的提出,進(jìn)一步推動了光合色素在海洋生態(tài)學(xué)研究中的應(yīng)用。

海水中光合色素的提取、分離、定性和定量分析是應(yīng)用光合色素法準(zhǔn)確評價水體中浮游植物生物量及類群組成的前提和基礎(chǔ)。但由于光合色素種類繁多,分子結(jié)構(gòu)差異不大,且對光、溫、酸堿、氧十分敏感,個別光合色素還會形成同分異構(gòu)體,特定海區(qū)特定光合色素濃度較低等特點,給光合色素的提取、分離、定性與定量過程帶來較大困難。目前反相高校液相色譜法是國內(nèi)外光合色素的分離、分析的首推方法。借助該方法,國內(nèi)研究者已能將大量的葉綠素及類胡蘿卜素進(jìn)行很好的分離[8-9]。陳紀(jì)新等[10]借助二極管陣列檢測器(DVD),選擇合理的洗脫程序,能將葉綠素a(Chla)和二乙烯基葉綠素a(DV-Chla)較好地分離。而姚鵬等[11]和朱卓毅[12]在Zapata等[13]方法基礎(chǔ)上做一定修改后,同樣獲得了Chl a和DV-Chl a較好的分離效果。但目前在光合色素的定性、定量方面的專門研究還較少,實際分析工作中常會遇到不少問題,比如光合色素濃度與色譜峰面積的轉(zhuǎn)換系數(shù)(fp)不準(zhǔn)確,將無法準(zhǔn)確估算水體中光合色素的實際濃度,也影響文獻(xiàn)數(shù)據(jù)之間的可比性。作者購買通過藻類單種純培養(yǎng)獲得的高純度光合色素標(biāo)準(zhǔn)品(丹麥 DHI-14C公司),采用 Furuya等[14]的提取方法、在Balow等[15]和陳紀(jì)新等[16]的分離方法基礎(chǔ)上做一定修改后,分析測定了19種關(guān)鍵的浮游植物光合色素的保留時間、吸收光譜、最大吸收波長(λmax)、校正曲線及響應(yīng)因子(fp)等參數(shù),并對影響各參數(shù)的因素進(jìn)行討論與分析,為國內(nèi)同行在相關(guān)領(lǐng)域的研究提供借鑒與參考。

1 材料和方法

1.1 儀器與材料

儀器：Agilent l100 Series液相色譜工作站,結(jié)合二極管陣列檢測器(DAD),Eclipse XDB C8色譜柱(Agilent,Germany)。

材料：光合色素標(biāo)準(zhǔn)品,從丹麥DHI-14C公司購買,光合色素標(biāo)準(zhǔn)品的名稱(中文名稱、英文名稱及縮寫)、初始濃度及溶解體系如表1所示。

表1 光合色素標(biāo)準(zhǔn)品的名稱、縮寫、濃度及溶解體系Tab.1 The names,abbreviations,concentrations and solvents of the photosynthetic pigments

1.2 方法

1.2.1 洗脫程序

光合色素的高效液相色譜分析流動相由A和B組成,其中 A 為V甲醇：V1M乙酸銨=4：1,B 為 100%甲醇。洗脫程序如表2所示。

表2 光合色素HPLC分離分析梯度洗脫程序Tab.2 The linear gradient elution protocol of HPLC-based photosynthetic pigment analysis

1.2.2 響應(yīng)因子測定

將購得的光合色素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋(至少4個濃度梯度),測定不同濃度的譜峰面積(檢測波長為 440 nm),以光合色素濃度Cp作為 y軸,峰面積 Ap作為x軸,以光合色素濃度和峰面積作散點圖,通過線性回歸得出線性方程(1),其斜率即為響應(yīng)因子(fp)。

1.2.3 定量

各光合色素標(biāo)準(zhǔn)品在不同稀釋濃度下進(jìn)行色譜分析,測得不同濃度下各色素在440 nm波長的峰面積。利用校正因子fp,根據(jù)公式(2)進(jìn)行光合色素濃度的計算：

式中,Cs為光合色素質(zhì)量濃度,單位為ng/L;Ap各光合色素洗脫峰的面積,單位為mAU*s;fp為各光合色素濃度與峰面積線性回歸方程的斜率,單位為mg/mAU;vext為進(jìn)行色素抽提時所用提取液體的體積,單位為10-3L;vfilt為采樣時過濾海水的體積,單位為10-3L;vinj為高效液相色譜分析時的進(jìn)樣體積,單位為10-3L; B為緩沖液的稀釋因子。

2 結(jié)果

2.1 光合色素標(biāo)準(zhǔn)品純度的檢驗

標(biāo)準(zhǔn)光合色素在運輸、保存過程中會因出現(xiàn)不同程度的降解而純度下降。因此,標(biāo)準(zhǔn)品使用前必須檢驗其純度。標(biāo)準(zhǔn)品的純度檢驗通過 Chem-station程序完成。具體操作是分段檢測光合色素標(biāo)準(zhǔn)品在440 nm的吸收峰峰寬范圍內(nèi)的吸收光譜特征,結(jié)果顯示,各光合色素標(biāo)準(zhǔn)品在峰寬范圍內(nèi)各時間點的吸收光譜重疊較好,表明標(biāo)準(zhǔn)品純度高。(圖 1a為BUT440 nm的吸收峰,圖1b為BUT在吸收峰的范圍內(nèi)分段檢測其吸收光譜)。

圖1 光合色素19-丁?；趸瘞r藻黃素的純度檢驗Fig.1 Confirmation of the peak purity on the example of 19’-butanoyloxy -fucoxanthin

2.2 光合色素的液相色譜分離

混合標(biāo)準(zhǔn)品的色譜分析情況如圖2所示。在本實驗體系下各種標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間均小于 32 min,表明該方法有較高的樣品分析速率。另外,該方法能將DV-Chla和Chla,LUT和ZEA,Chlb和DV-Chlb等極性差異不大的光合色素較好地分離,但是Chlc1和Chlc2仍然是在同一個峰中被洗脫出來。

圖2 反相高效液相色譜對混合標(biāo)準(zhǔn)光合色素的色譜分析圖Fig.2 RP-HPLC chromatograms of mixed photosynthetic pigment standards

2.3 光合色素的吸收譜峰

在本實驗體系下,葉綠素類及類胡蘿卜素類在300～800 nm波長范圍內(nèi)的吸收光譜特征如圖3及圖4所示。葉綠素類均存在兩個較強(qiáng)吸收峰,其一位于藍(lán)光區(qū)(300～500 nm),另一個區(qū)域在紅光區(qū)(550～700 nm)。Chla及DV-Chla(圖3e、f)在兩個區(qū)域的最大吸收波長處的吸收強(qiáng)度相當(dāng),Chlc(圖3a、b)在紅光區(qū)最大吸收波段的吸收強(qiáng)度則明顯弱于藍(lán)光區(qū)。Chlb及DV-Chlb(圖3c、d)在410 nm處存在吸收的相對低值。因此,根據(jù)吸收光譜特征上的差異完全可以將Chla、b和c區(qū)分開來。

雖然Chla與DV-Chla吸收光譜的形狀非常相似,但它們之間也存在差異(圖3e、f)。Chla在藍(lán)光區(qū)的最大吸收波長為432 nm,而DV-Chla的最大吸收波長紅移了 10 nm,為 442 nm。類似的情況在Chlb與DV-Chlb之間也存在,DV-Chlb的最大吸收波長紅移了8 nm。因此,雖然Chla/b與DV-Chla/b的保留時間非常接近,憑此差異也完全可以將二者區(qū)分。

圖3 葉綠素類光合色素的光吸收光譜特征Fig.3 Absorption spectra of Chlorophylls

類胡蘿卜素對可見光的吸收主要在藍(lán)光區(qū),波長范圍在 350～550 nm。在此范圍內(nèi),一般情況下均有 2～3個吸收峰(圖 4d、g),但是會因溶劑不同而有所差異。若以Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ表示波長由短至長的三個吸收峰,Ⅰ和Ⅲ通常會因發(fā)色基團(tuán)的干擾而形成肩峰,如DIAD、ALL和DIAT等,Ⅰ已經(jīng)形成了肩峰,Ⅲ保留較好(圖4h、i、j)。個別光合色素的Ⅰ和Ⅲ也會被Ⅱ完全覆蓋而形成單峰特征,如 PER和CANT(如圖 4a、m)。

與葉綠素類相比,類胡蘿卜素類之間的吸收光譜差異較小,有些光合色素最大吸收波長僅差 1～2 nm。如,PERI和CAN,只有Ⅱ出現(xiàn),且只相差1 nm。而DIAD、ALL和DIAT的Ⅰ均為肩峰,Ⅱ的波長相同,只有Ⅲ有微小的差別。因此,僅憑Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的差異很難將其區(qū)分; 而不同溶劑對Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的波長也會有影響,這進(jìn)一步加大了它們之間的定性難度。因此,在定性過程中必須參考光合色素的保留時間。

2.4 光合色素的定量

各已知濃度的色素標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)過一系列稀釋,并與測得的440 nm波長的峰面積進(jìn)行線性回歸得出的校正工作曲線如圖 5所示,響應(yīng)系數(shù)(fp),保留時間及其最大吸收波長如表3所示。

由表可知,不同的光合色素的響應(yīng)系數(shù)差別較大。Chla、Chlb、DV-Chla和PRA的fp值較高,分別為0.417,0.505,0.276和0.25。表明該類光合色素的儀器信號較弱; 而 Chlc2,FUCO,VIO,DIAD,NEO,ALL,DIAT,ZEA以及β-CAR等fp值較低,其值均低于 0.1; 其他光合色素的fp值介于 0.2和 0.1之間。

3 討論

3.1 光合色素的定性

3.1.1 保留時間

圖4 利用反相高效液相色譜測得類胡蘿卜素的光吸收光譜特征Fig.4 Absorption spectra of carotenoids obtained

圖5 標(biāo)準(zhǔn)光合色素的回歸曲線Fig.5 Calibration curves for the photosynthetic pigment standards

保留時間是對光合色素進(jìn)行定性的一個重要參數(shù)。在一定的體系中各光合色素的保留時間是相對穩(wěn)定的。但是在進(jìn)行樣品分析時,通常會發(fā)生保留時間漂移現(xiàn)象。此現(xiàn)象的發(fā)生可能是環(huán)境溫度、流動相、色譜柱性質(zhì)發(fā)生改變產(chǎn)生導(dǎo)致,如流動相脫氣過程會改變流動相的氣壓平衡,而且一輪梯度洗脫后固定相極性是否回到初始狀況等均會使保留時間改變。因此,進(jìn)行樣品分析前應(yīng)先進(jìn)甲醇空白樣分析,以保證樣品分析前流動相氣壓達(dá)到平衡。另外,將分離柱放置在柱恒溫器或水浴中,可達(dá)到穩(wěn)定分析柱溫度(變化范圍＜0.1℃),有利于改善保留時間漂移現(xiàn) 象。

表3 光合色素標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間、響應(yīng)因子(fp)、相關(guān)系數(shù)及最大吸收波長Tab.3 Retention times,response factors,important coefficients and wavelengths of the absorption maxima of pigments in RP-HPLC analysis

3.1.2 出峰順序

出峰順序是由各光合色素的相對極性所決定,與提取劑、流動相的組成及分析柱的選擇緊密相關(guān),但在一定的體系下是相對穩(wěn)定的。本研究中HEX的保留時間短于VIO,因而先被洗脫出峰。而在某些方法中,如Van等[17]的方法中,二者的出峰順序與本研究剛好相反。在Stón等[18]的方法中,HEX的極性變化更大,其峰先于NEO。此外,本研究中ZEA和LUT兩峰的先后順序也與Stón等[18]恰好相反。因此在對以上這幾個光合色素的定性時必須結(jié)合其保留時間和吸收光譜來加以判斷。另外,光合色素的吸收光譜特征也會隨分析體系的差異而有所不同。因此,最佳的定性方法是在光合色素標(biāo)準(zhǔn)品的輔助下,獲得自己的分析體系下各種光合色素的保留時間以及吸收光譜特征。

3.2 光合色素的定量

3.2.1 光合色素標(biāo)準(zhǔn)品的獲得

光合色素標(biāo)準(zhǔn)品的獲得有兩種途徑,其一,從化學(xué)藥品公司購買,如Chla、Chlb和 β-CAR可從Sigma-Aldrich公司購得,ZEA和LUT可以從Roth化學(xué)試劑公司購買。但由于商業(yè)途徑提供的光合色素標(biāo)準(zhǔn)品的種類有限,往往難以滿足對海洋中主要光合色素的定性、定量需求。雖然丹麥 DHI-14C公司提供了種類較全的光合色素標(biāo)準(zhǔn)品,但其量少(2.5 mL),濃度也不夠高,使得樣品中的光合色素濃度落在工作曲線之外。另外,該標(biāo)準(zhǔn)品一旦拆封后就得立即使用。若拆封后需要保存一段時間后繼續(xù)使用,則必須確定標(biāo)準(zhǔn)品是否降解,并采用分光光度法重新標(biāo)定濃度。相對其高昂的價格,這不是經(jīng)濟(jì)的選擇。其二,利用藻類的純種培養(yǎng)自己制備。利用制備或半制備型 HPLC將需要的光合色素分離純化、收集后用分光光度法,根據(jù)其最大波長處的消光系數(shù)進(jìn)行濃度標(biāo)定,濃度計算如公式(3)所示：

其中Cd為光合色素質(zhì)量濃度,單位為mg/L,Amax是在最大吸收波長下的吸光值,A750nm表示在750nm處的吸光值,l為比色皿的寬度,E為光合色素在最大吸收波長下的消光系數(shù)[18,19],該值如表4所示。

表4 在一定溶劑下各光合色素在最大吸收波長處的消光系數(shù)Tab.4 Extinction coefficients of pigments at the maximum absorb wavelengths

但是這個過程較為繁瑣,且必須具備含有目標(biāo)光合色素的藻株。有些特征光合色素含有的藻株在實驗室內(nèi)較難培養(yǎng)。部分藻株需從美國 Provasoli-Guillard國家海洋藻類培養(yǎng)中心(CCMP)購買。

3.2.2 響應(yīng)因子(fp)

響應(yīng)因子是色譜光電信號轉(zhuǎn)化成光合色素濃度的關(guān)鍵系數(shù),不同光合色素的響應(yīng)因子不同。將本研究的fp值與文獻(xiàn)值[20]線性相關(guān)性分析,得到線性方程為y=1.045x,R2值為 0.957,且斜率接近 1(圖 6)。但各點的分布雖然靠回歸曲線很近,但并未完全落于線上,表明二者之間仍然有差異,這可能是實驗體系差異導(dǎo)致。Stoń等[18]比較了 LiChroCART Hypersil ODS 和 LiChroCART LiChrospher 100 RP1兩款不同色譜柱在相同的流動相及柱溫條件下各種光合色素的響應(yīng)因子的差異,發(fā)現(xiàn)響應(yīng)因子受固定相的影響較大,且變化規(guī)律不同。如,Chlb,采用不同的分離柱測得其fp值分別為0.427 5和0.600 9,之間相差將近50%; 本研究所得的fp值介于二者之間,為0.505。但采用不同的分離柱測得的Chla的fp值差別不大,分別為0.445 8和0.414 7; 本研究中Chla的fp為0.417。若使用不同的fp值計算同一個樣品時,會使得Chlb的濃度差別較大,而Chla濃度變化不大。而PRAS與Chlb情況類似。因此,在選用不同類型色譜柱或更換新的色譜柱時,必須重新測定fp值。另外,高效液相色譜的光源更換、儀器搬運也可能會導(dǎo)致電信號的波動,fp會發(fā)生變化,也需對其重新測定。

圖6 fp實測值與文獻(xiàn)值之間的的相關(guān)性分析Fig.6 Relationship between the fp tested and the fp from references

4 小結(jié)

利用本實驗室建立的RP-HPLC實驗體系,分析了19種浮游植物常見光合色素標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間、吸收光譜、最大吸收波長、校正曲線及響應(yīng)因子等參數(shù)。結(jié)果顯示,在該實驗體系下,19種光合色素都能夠較好地分離和檢測,但HEX與NEO、PRA之間及LUT和ZEA之間的出峰順序與文獻(xiàn)報道的其他實驗體系的結(jié)果有所差異。因此,對以上光合色素進(jìn)行定性時,不但要參考色素的出峰順序、保留時間,還必須同時參考色譜峰的吸收光譜特征。另外,通過將本研究獲得的光合色素的響應(yīng)因子(fp)與文獻(xiàn)值進(jìn)行比較,作者發(fā)現(xiàn)不同光合色素的響應(yīng)因子在不同的實驗體系下的變化趨勢不同。因此,當(dāng)分析實驗體系或儀器狀態(tài)發(fā)生改變時,不能繼續(xù)沿用原先的fp值來計算光合色素的濃度,而應(yīng)當(dāng)利用光合色素標(biāo)準(zhǔn)品對fp進(jìn)行重新測定。

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