袁 鵬 臧嬋媛 周 偉 劉學(xué)政

糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）是糖尿病最具破壞性的眼部并發(fā)癥，DR可對(duì)視力造成不可挽回的影響，早期預(yù)防和治療DR成為研究者關(guān)注的熱點(diǎn)?？Х人岜揭阴ィ–APE）是一種從蜂膠中分離出的酚類物質(zhì)，具有抗炎、抗氧化應(yīng)激和免疫調(diào)節(jié)作用，為一種有效的特異性核因子（KF）-κB抑制劑[1]。糖尿病狀況下，升高的炎性介質(zhì)、活性氧化產(chǎn)物和糖基化終末產(chǎn)物可作為細(xì)胞外信號(hào)進(jìn)一步激活NF-κB[2]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究CAPE對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞間黏附因子（ICAM）-1和視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）蛋白表達(dá)的影響，以期觀察CAPE在治療DR中的藥理作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料 雄性清潔級(jí)SD大鼠40只，體質(zhì)量200～220 g，購(gòu)自遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，于溫度為25℃、濕度為40%的動(dòng)物房普通飼料喂養(yǎng)。鏈脲佐菌素（STZ）購(gòu)自Sigma公司，CAPE購(gòu)自美國(guó)IL公司，VEGF和ICAM-1酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司；One TouchⅡ血糖測(cè)定儀購(gòu)自美國(guó)強(qiáng)生Lifescan公司，超聲波細(xì)胞破碎儀（VCX105型，Sonics&materials公司），離心機(jī)（1-14型，Sigma公司），酶標(biāo)儀（DNM-9606型，北京普朗新技術(shù)有限公司）。

1.2 模型制備與分組 大鼠禁食12 h后，按45 mg/kg尾靜脈注射1%STZ溶液[0.1 mol/L的檸檬酸和檸檬酸鈉緩沖液（pH 4.5）配制]；48 h后尾靜脈采血測(cè)血糖，以后每月測(cè)1次，將血糖濃度大于16.7 mmol/L的大鼠定為糖尿病模型大鼠。取30只糖尿病模型大鼠隨機(jī)分為3組，每組10只：DM組不使用任何藥物，CAPE5組按5 mg/kg每3 d腹腔注射CAPE，CAPE10組按10 mg/kg每3 d腹腔注射CAPE，3個(gè)月后以上3組各剩下8、8、9只大鼠。另取10只SD大鼠，注射等劑量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液作為正常對(duì)照組（CON組）。

1.3 ELISA檢測(cè)視網(wǎng)膜VEGF和ICAM-1蛋白水平 水合氯醛麻醉全部大鼠并斷頸處死，迅速摘除大鼠雙側(cè)眼球（左眼用于VEGF蛋白水平測(cè)定，右眼用于ICAM-1蛋白水平測(cè)定），顯微鏡下，沿角膜鞏膜緣切開(kāi)眼球，去除晶體及玻璃體，剪碎視網(wǎng)膜，加入150 μL預(yù)冷的組織裂解液。裂解液組成：20%甘油，10 mmol/L KCl，1 mmol/L MgCl2，0.1%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton），300 mmol/L NaCl，0.5 mmol/L二硫蘇糖醇，0.1 mmol/L苯甲基磺酰氟，20 mmol/L羥乙基哌嗪乙磺酸（pH 7.9）。視網(wǎng)膜在冰浴中超聲粉碎2個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)5 s，4℃下14 000 r/min離心15 min，取上清液2 μL使用BCA法進(jìn)行蛋白定量，另取100 μL上清液按試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)視網(wǎng)膜組織中的VEGF和ICAM-1水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以±s表示，多組資料比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

4組大鼠視網(wǎng)膜VEGF和ICAM-1蛋白水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。除CAPE5和CAPE10組間VEGF水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（均P＞0.01），其他各組兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），見(jiàn)表1。

表1 4組大鼠視網(wǎng)膜VEGF及ICAM-1水平比較（μg/g，±s）

表1 4組大鼠視網(wǎng)膜VEGF及ICAM-1水平比較（μg/g，±s）

＊＊P＜0.01

CON（1）DM（2）CAPE5（3）CAPE10（4）F 10 889 0.85±0.11 2.43±0.17 1.45±0.19 1.41±0.22 125.05＊＊組比（1）∶（2）（2）∶（3）（3）∶（4）（2）∶（4）P＜0.001＜0.001 0.666＜0.001 3.71±0.15 7.97±0.26 5.69±0.32 4.43±0.19 564.84＊＊組比（1）∶（2）（2）∶（3）（3）∶（4）（2）∶（4）P＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理組別 n VEGF水平ICAM-1水平

3 討論

許多炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子參與了DR的發(fā)生與發(fā)展，這些因子相互作用形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和相互關(guān)聯(lián)的作用通路，共同影響DR的發(fā)生和發(fā)展，因此對(duì)這些細(xì)胞因子及其下游通路的抑制已成為治療早期DR的重要方法。

Joussen等[3]研究表明DR與慢性炎癥反應(yīng)有諸多相似之處，ICAM-1介導(dǎo)的白細(xì)胞和視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附在DR的發(fā)生發(fā)展中起始動(dòng)作用，白細(xì)胞黏附可引起視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡、毛細(xì)血管無(wú)灌注的形成及血視網(wǎng)膜屏障的破壞，使用ICAM-1中和抗體可對(duì)DR起保護(hù)作用[4]。本研究結(jié)果表明，CAPE能明顯抑制糖尿病大鼠視網(wǎng)膜ICAM-1蛋白的表達(dá)水平，從而抑制糖尿病大鼠早期視網(wǎng)膜病變。

VEGF是受NF-κB調(diào)控的促血管生長(zhǎng)因子之一[5]，VEGF可通過(guò)誘導(dǎo)ICAM-1的表達(dá)引起炎癥反應(yīng)，是血視網(wǎng)膜屏障破壞和視網(wǎng)膜新生血管形成的主要調(diào)節(jié)因子，在DR的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。本研究結(jié)果表明，使用CAPE后糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的VEGF蛋白表達(dá)水平得到了明顯抑制，因此CAPE可通過(guò)抑制VEGF的蛋白表達(dá)水平對(duì)DR起保護(hù)作用。

活化的NF-κB可介導(dǎo)ICAM-1、白介素-1β、腫瘤壞死因子-α和環(huán)氧酶-2等與DR發(fā)生密切相關(guān)的細(xì)胞因子的表達(dá)，被視為糖尿病微血管病變的中心調(diào)控因子。作為一種有效的特異性NF-κB抑制劑，CAPE可能通過(guò)抑制糖尿病狀況下升高的NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性減少VEGF和ICAM-1的表達(dá)。同時(shí)CAPE還可能通過(guò)抑制TGF-β2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路間接對(duì)VEGF的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控[6]。CAPE對(duì)ICAM-1和VEGF蛋白表達(dá)水平的機(jī)制還有待深入研究，這也將為CAPE治療DR提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。

[1]Natarajan K,Singh S,Burke TR Jr,et al.Caffeic acid phenethyl ester is a potent and specific inhibitor of activation of nuclear transcrip?tion factor NF-kappa B[J].Proc Natl Acad Sci USA,1996,93(17): 9090-9095.

[2]Kowluru RA,Odenbach S.Role of interleukin-1beta in the patho?genesis of diabeticretinopathy[J].Br J Ophthalmol,2004,88(10): 1343-1347.

[3]Joussen AM,Poulaki V,Le ML,et al.A central role for inflamma?tion in the pathogenesis of diabetic retinopathy[J].Faseb,2004,8(12): 1450-1452.

[4]Miyamoto K,Khosrof S,Bursell SE,et al.Prevention of leukostasis and vascular leakage in streptozotocin-induced diabetic retinopa?thy via intercellular adhesion molecule-1 inhibition[J].Proc Natl Acad Sci USA,1999,96(19):10836-10841.

[5]Bian ZM,Elner SG,Elner VM.Regulation of VEGF mRNA expres?sion and protein secretion by TGF-beta2 in human retinal pigment epithelial cells[J].Exp Eye Res,2007,84(5):812-822.

[6]Fujioka S,Sclabas GM,Schmidt C,et al.Inhibition of constitutive NF-kappa B activity by I kappa B alpha M suppresses tumorigene?sis[J].Oncogene,2003,22(9)：1365-1370.