趙金超 張 瑞 汪蓓蕾 郭 剛

甲狀腺素是哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育最重要的激素之一。同源盒基因是在進(jìn)化上高度保守的DNA序列。同源盒基因Nkx家族中的許多成員在腦組織中的不同區(qū)域表達(dá)，提示其可能參與了不同腦區(qū)的發(fā)育過(guò)程[1]。研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充甲狀腺素與腦組織Nkx2.1[2]及Nkx6.1[3]的基因表達(dá)水平存在相關(guān)性。關(guān)于Nkx2.2的研究目前多集中在其對(duì)胰腺功能的影響[4]，以及對(duì)于少突膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)臟運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元分化的影響[5]等方面。而關(guān)于其與甲狀腺素方面的研究較少。本研究通過(guò)對(duì)妊娠早、晚期甲狀腺功能減低（甲低）孕鼠補(bǔ)充不同劑量的甲狀腺素，探討甲狀腺素對(duì)子代大鼠腦組織中同源盒基因Nkx2.2表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型制作與分組 選用斷乳1個(gè)月的雌、雄性SPF/ VAF級(jí)Wistar大鼠（購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）各120只，體質(zhì)量100～120 g。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將雌性大鼠隨機(jī)分為2組：對(duì)照組（15只），甲低組（105只），甲低組鼠均飼以重度缺碘地區(qū)糧食配制的飼料，成分為玉米∶黃豆∶小麥∶小米＝3∶3∶3∶1，另外添加必需氨基酸、維生素和無(wú)機(jī)鹽等，飼料經(jīng)過(guò)食品中堿的灰化-砷鈰催化分光光度法測(cè)定，含碘量為13.66 ng/g。甲低組均飲去離子水；對(duì)照組飲含碘量為200 μg/L碘酸鉀溶液，總碘攝入量相當(dāng)于大鼠生理碘需要量。飼養(yǎng)3個(gè)月后，于大鼠內(nèi)眥取血，測(cè)定血清甲狀腺素，當(dāng)各甲低組大鼠血清總?cè)饧谞钕僭彼幔═T3）、總甲狀腺素（TT4）、游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）及游離甲狀腺素（FT4）水平與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，表明甲低模型復(fù)制成功。然后將甲低組隨機(jī)分為甲低和甲低孕鼠妊娠1～17 d（孕早期甲低）補(bǔ)充甲狀腺素高、中、低劑量組，甲低孕鼠妊娠18～20 d（孕晚期甲低）補(bǔ)充甲狀腺素高、中、低劑量組，每組15只。高、中、低劑量組每天每100 g體質(zhì)量分別補(bǔ)充甲狀腺素3.5、2.0和0.5 μg。將8組雌鼠與正常Wistar雄性大鼠（食用正常飼料）按1∶1進(jìn)行交配。次日晨檢測(cè)陰栓，做陰道涂片，發(fā)現(xiàn)精子確定為妊娠0 d，8組孕鼠分別取孕17 d、新生當(dāng)天、生后20 d的子鼠間腦組織，液氮速凍后，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要儀器與試劑 Taq DNA聚合酶、dNTPs、T4DNA連接酶、EcoRⅠ、pGEM?-T Easy Vector（美國(guó)Promega公司）；二硫蘇糖醇（DTT）、Trizol、M-MLV、RNA酶抑制劑、SYBR?Green Mix（美國(guó)Invitrogen公司）；DNA Marker DL-2000、DNA純化回收試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；引物合成和測(cè)序由上海博亞生物公司完成。Contifuge 17RS臺(tái)式冷凍離心機(jī)（德國(guó)Heraeus公司）；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real time-PCR）儀購(gòu)自LightCycler，瑞士Roche公司。

1.3 總RNA提取和cDNA合成 分別取孕17 d、新生當(dāng)天、生后20 d子鼠間腦組織100 mg，采用Trizol一步法提取腦組織總RNA，利用分光光度計(jì)，在波長(zhǎng)為230、260、280 nm時(shí)，測(cè)定總RNA的吸光度（A）值，當(dāng)A260/A280為1.7～2.0、A260/A230為1.5～1.9時(shí)，說(shuō)明總RNA純度較高，基本去除了蛋白質(zhì)和糖類等其他物質(zhì)的污染。各管分別加入2 μg總RNA樣品，用Oli?go（dT）181 μL（1 g/L）、dNTPs 1 μL（10 mmol/L）和DEPC水補(bǔ)齊至總體積12 μL?；靹蚝?0 000 r/min瞬時(shí)離心5 s，65℃5 min后立即冰?。患尤?×Buffer 4 μL，0.1 mol/L DTT 2 μL，RNA酶抑制劑1 μL（40 U），混勻，37℃2 min，立即冰浴，再加入M-MLV 1 μL（200 U），總體積20 μL?；靹颍?0 000 r/min瞬時(shí)離心5 s，37℃50 min，70℃15 min，-20℃保存。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real time-PCR） 各引物序列利用Gene Runner軟件設(shè)計(jì)，經(jīng)NCBI BLAST檢索無(wú)顯著同源性序列。Nkx2.2引物：上游5-GCCTCCAATACTCCCTG CAC-3，下游5-CTCGTAG GTCTGCGCTTTG-3，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為182 bp；管家基因GAPDH：上游5-ACAGCAACTCCCAT TCTT-3，下游5-TCCAGGGTTTCTTACTCC-3，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為160 bp。依據(jù)總RNA的質(zhì)量，將cDNA稀釋成每微升所含cDNA量來(lái)源于20 ng總DNA。PCR反應(yīng)體系：總體積20 μL，含SYBR?Green MIX 10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，cDNA 2 μL，雙蒸水7.0 μL；反應(yīng)條件：95℃3 min；95℃5 s，61℃10 s，72℃15 s，40個(gè)循環(huán)。通過(guò)測(cè)定PCR產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)累積量，獲得樣品的擴(kuò)增曲線。然后進(jìn)行融解曲線分析：95℃0 s，65℃15 s，95℃0 s，用待測(cè)樣品2-△Ct值表示目的基因相對(duì)表達(dá)量，Ct是每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)一定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)；樣品△Ct=目的基因Ct值-GAPDH Ct值。1.5 構(gòu)建大鼠Nkx2.2反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物克隆載體 回收純化的Nkx2.2 cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物，在T4DNA連接酶作用下，克隆入pGEM?-T Easy Vector，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，抗生素篩選陽(yáng)性菌落。提取質(zhì)粒DNA，用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ（pGEM?-T Easy Vector的A-T連接位點(diǎn)兩側(cè)各有1個(gè)EcoRⅠ位點(diǎn)）進(jìn)行酶切鑒定，篩選有DNA片段插入者進(jìn)行序列測(cè)定。1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，數(shù)據(jù)以±s表示，采用單因素方差分析，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)不同組的兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Nkx2.2擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定 重組克隆載體pGEM-Te/Nkx2.2經(jīng)EcoRⅠ酶切電泳后可清晰見(jiàn)到約182 bp處出現(xiàn)目的條帶，同時(shí)3 000 bp處有質(zhì)粒片段，見(jiàn)圖1。

圖1 pGEM-Te/Nkx-2.2酶切結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 Real time-PCR結(jié)果 Nkx2.2和GAPDH的擴(kuò)增和融解曲線見(jiàn)圖2。在孕17 d，甲低組的Nkx2.2 mRNA表達(dá)水平低于對(duì)照組，其他6個(gè)補(bǔ)充甲狀腺組的mRNA表達(dá)水平均高于對(duì)照組；在新生當(dāng)天和生后20 d，除孕晚期甲低補(bǔ)充甲狀腺素中劑量組外，其他各甲低組的Nkx2.2 mRNA表達(dá)水平均低于對(duì)照組；在生后20 d，孕早期甲低補(bǔ)充甲狀腺素低、中、高劑量組的Nkx2.2 mRNA表達(dá)水平與甲低組差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組組內(nèi)不同時(shí)期基因表達(dá)情況比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表1。

表1 8組大鼠腦組織中Nkx2.2 mRNA表達(dá)情況（n=15，×10-5，±s）

表1 8組大鼠腦組織中Nkx2.2 mRNA表達(dá)情況（n=15，×10-5，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 孕17 d 新生當(dāng)天 生后20 d F對(duì)照組（1）甲低組（2）孕早期甲低低劑量組（3）中劑量組（4）高劑量組（5）孕晚期甲低低劑量組（6）中劑量組（7）高劑量組（8）F t（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（1）∶（5）（1）∶（6）（1）∶（7）（1）∶（8）（2）∶（3）（2）∶（4）（2）∶（5）2.24±0.14 1.53±0.30 18.90±5.11 3.16±0.15 26.10±7.43 8.09±7.01 39.03＊＊7.04＊＊4.58±1.27 3.97±2.94 7.87±3.67 1.32±0.26 12.80±2.23 8.80±0.08 11.10±0.00 9.68±0.62 7.01±4.04 17.63＊＊13.16＊＊22.49＊＊14.22±10.30 14.90±10.31 15.30±10.10 7.08＊＊3.625＊4.977＊4.001＊10.830＊22.603＊＊24.800＊＊37.689＊＊6.385＊6.112＊6.106＊7.99±0.61 20.50±3.63 9.85±1.32 19.00＊＊56.092＊＊87.239＊＊21.660＊＊68.112＊＊55.670＊＊0.331 50.223＊＊13.730＊57.382＊＊19.008＊＊10.80±0.40 26.60±10.30 18.60±9.70 24.65＊＊101.573＊＊86.370＊＊90.022＊＊122.056＊＊78.933＊＊0.321 64.185＊＊0.411 0.347 0.386 15.18＊＊38.37＊＊12.24＊＊

3 討論

腦在發(fā)育時(shí)期是甲狀腺素的一個(gè)靶器官。缺碘對(duì)處于發(fā)育中的腦可造成不可逆轉(zhuǎn)的損害，這種損害與宮內(nèi)胚胎發(fā)育的特定階段具有極其密切的關(guān)系。同源盒基因是首先在果蠅中發(fā)現(xiàn)的由180～183個(gè)堿基組成的保守序列，該序列編碼的60～61個(gè)氨基酸所構(gòu)成的多肽區(qū)域，稱為同源結(jié)構(gòu)域或同源盒，為DNA結(jié)合蛋白，能調(diào)節(jié)其他基因的表達(dá)。同源盒基因Nkxs與神經(jīng)系統(tǒng)的分化與發(fā)育關(guān)系極為密切。它們大都只是在胚胎發(fā)育期表達(dá)，出生后很少表達(dá)甚至不再表達(dá)[6]。Nkx2.2基因是Nkxs家族中的重要一員，它主要表達(dá)于腹側(cè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)及胰腺。研究發(fā)現(xiàn)，Nkx2.2基因敲除小鼠的髓鞘堿性蛋白（MBP）陽(yáng)性與髓鞘蛋白脂質(zhì)蛋白（PLP）陽(yáng)性的少突膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)顯著延遲，而且數(shù)量明顯減少[7]?？梢?jiàn)在腦和脊髓中，Nkx2.2同源轉(zhuǎn)化盒基因?qū)ι偻荒z質(zhì)細(xì)胞的分化和成熟有著重要的調(diào)節(jié)作用[8]。在本實(shí)驗(yàn)?zāi)X組織取材部位定為單側(cè)大腦半球中1/3腹側(cè)處，即間腦組織，利用Real time-PCR技術(shù)對(duì)不同給藥劑量甲低孕鼠的子代大腦組織Nkx2.2的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定。發(fā)現(xiàn)在孕17 d、新生及生后20 d甲低組Nkx2.2的表達(dá)水平均低于對(duì)照組。在不同時(shí)期給予孕鼠不同劑量的甲狀腺素對(duì)Nkx2.2表達(dá)量有較大的影響。其中，在低碘孕鼠的孕晚期給予中等劑量的甲狀腺激素可以使Nkx2.2的表達(dá)水平得到明顯改善，并與對(duì)照組同時(shí)期水平接近。筆者推測(cè)，低碘導(dǎo)致的腦發(fā)育遲滯可能與Nkx2.2表達(dá)量的缺乏有關(guān)，而在孕晚期給予中等劑量甲狀腺素可以使甲狀腺功能低下的孕鼠的子代達(dá)到正常的基因表達(dá)量，能夠起到很好的治療效果。此項(xiàng)研究側(cè)重于分子機(jī)制方面的基礎(chǔ)研究，對(duì)妊娠早期常規(guī)篩查和監(jiān)測(cè)孕婦的甲狀腺激素水平能起到一定的指導(dǎo)作用，并為孕期防治新生兒甲低提供理論支持。關(guān)于甲狀腺激素和同源盒基因Nkx2.2之間調(diào)控表達(dá)的具體作用機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。

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