于俊娜 牛文彥

骨骼肌是攝取葡萄糖維持血糖穩(wěn)態(tài)的重要器官，胰島素和骨骼肌收縮以不同的信號(hào)機(jī)制促進(jìn)胞漿中的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子4（glucose transporter 4，GLUT4）轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜上增加葡萄糖攝取量[1]。氨乙酰膽堿（Carbachol，Cch）是乙酰膽堿的穩(wěn)定類似物，可去極化骨骼肌細(xì)胞膜，造成收縮[2]。在培養(yǎng)的小鼠C2C12骨骼肌細(xì)胞中使用Cch可模擬運(yùn)動(dòng)的作用[3]。Ca2+通過許多鈣敏感激酶進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)。本研究通過測(cè)定C2C12小鼠骨骼肌細(xì)胞膜上的GLUT4myc的水平和鈣-鈣調(diào)素依賴型蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）的磷酸化水平，探討CaMKⅡ在收縮的骨骼肌細(xì)胞中促進(jìn)GLUT4myc轉(zhuǎn)位的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 C2C12 GLUT4myc骨骼肌細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室建立，Hanks液、DMEM（天潤(rùn)善達(dá)公司），胎牛血清（以色列Bioind公司），馬血清（美國(guó)Gibco公司），Blasticidin-HCl（德國(guó)Calbio?chem公司），抗myc抗體（美國(guó)Sigma公司），偶聯(lián)辣根過氧化物酶（HRP）的山羊抗兔抗體（美國(guó)Jackson Immuno Research公司），抗磷酸化CaMKⅡ抗體（美國(guó)Cell Signaling公司），偶聯(lián)HRP的山羊抗兔抗體、驢抗鼠IgM抗體（美國(guó)Jack son Immu?noResearch公司），增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光底物檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Milli?pore公司）。KN93、KN62（加拿大Calbiochem公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37℃，體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2條件下培養(yǎng)C2C12 GLUT4myc成肌細(xì)胞，將成肌細(xì)胞接種到培養(yǎng)板中，用含5%馬血清的DMEM高糖培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化為多核肌管，每2 d換液，于第5天用于實(shí)驗(yàn)。將培養(yǎng)板中的細(xì)胞無血清培養(yǎng)4 h后隨機(jī)分為對(duì)照組和Cch組，分別加入無血清培養(yǎng)基或100 μmol/L的Cch孵育10 min。各組分為抑制劑亞組和對(duì)照亞組，分別用于測(cè)定細(xì)胞膜上GLUT4myc的水平及檢測(cè)CaMKⅡ的磷酸化。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定細(xì)胞膜上GLUT4myc的水平 抑制劑亞組加入10 μmol/L抑制劑KN93或KN62于處理前30 min預(yù)孵育細(xì)胞。每亞組設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔。處理細(xì)胞后，多聚甲醛固定，甘氨酸淬滅，5%（V/V）的脫脂牛奶封閉后，用抗myc抗體室溫孵育1 h；用偶聯(lián)過氧化物酶HRP的山羊抗兔IgG室溫孵育1 h；加入底物鄰苯二胺溶液，反應(yīng)約20 min后終止，用酶標(biāo)儀測(cè)定上清液492 nm的吸光度值，重復(fù)4次。

1.2.3 Western blotting法檢測(cè)CaMK II的磷酸化 抑制劑亞組將10 μmol/L的KN93提前30 min加入細(xì)胞預(yù)孵育。處理細(xì)胞后，裂解細(xì)胞，65℃加熱15 min，體積分?jǐn)?shù)為0.075的SDS-PAGE電泳，免疫印跡檢測(cè)CaMKⅡ的磷酸化，一抗用CaMKⅡ磷酸化抗體，二抗用偶聯(lián)HRP的山羊抗兔抗體，以Actinin1作為內(nèi)參，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光底物試劑盒檢測(cè)，曝光，重復(fù)4次。結(jié)果用Image J軟件處理。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用單因素方差分析比較3組均數(shù)間的差異，3組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞表面GLUT4myc水平的比較 Cch使細(xì)胞膜上GLUT4myc的水平顯著增加（P＜0.01）。CaMKⅡ抑制劑KN93和KN62不影響對(duì)照組細(xì)胞膜上GLUT4myc的水平（P＞0.05），但抑制Cch組中對(duì)照亞組細(xì)胞膜上GLUT4myc的表達(dá)（P＜0.05或P＜0.01），見表1、2。

2.2 KN93對(duì)CaMKⅡ磷酸化的影響 Cch可增加CaMKⅡ的磷酸化，KN93不影響對(duì)照組CaMKⅡ的磷酸化水平，但可以抑制Cch刺激的CaMKⅡ磷酸化（P＜0.01），見表3、圖1。

表1 KN93對(duì)各組中細(xì)胞表面GLUT4myc水平的影響（n=12，±s）

表1 KN93對(duì)各組中細(xì)胞表面GLUT4myc水平的影響（n=12，±s）

＊＊P＜0.01

組別 相對(duì)于對(duì)照組中對(duì)照亞組的倍數(shù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理組比 P對(duì)照組 對(duì)照亞組（1）KN93亞組（2）Cch組 對(duì)照亞組（3）KN93亞組（4）F 1.00±0.00 1.09±0.10 1.74±0.14 1.24±0.02 46.007＊＊（1）∶（2）（1）∶（3）（3）∶（4）0.242＜0.001＜0.001

表2 KN62對(duì)各組中細(xì)胞表面GLUT4myc水平的影響（n=12，±s）

表2 KN62對(duì)各組中細(xì)胞表面GLUT4myc水平的影響（n=12，±s）

＊＊P＜0.05

組別 相對(duì)于對(duì)照組中對(duì)照亞組的倍數(shù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理組比 P對(duì)照組 對(duì)照亞組（1）KN62亞組（2）Cch組 對(duì)照亞組（3）KN62亞組（4）F 1.00±0.00 1.16±0.19 2.46±1.00 1.80±0.75 3.973＊＊（1）∶（2）（1）∶（3）（3）∶（4）0.756 0.009 0.035

表3 CaMKⅡ磷酸化水平倍數(shù)的比較（n=4，±s）

表3 CaMKⅡ磷酸化水平倍數(shù)的比較（n=4，±s）

＊P＜0.05

組別 相對(duì)于對(duì)照組中對(duì)照亞組的倍數(shù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理組比 P對(duì)照組 對(duì)照亞組（1）KN93亞組（2）Cch組 對(duì)照亞組（3）KN93亞組（4）F 1.00±0.00 1.19±0.41 2.98±1.54 1.27±0.18 5.24＊（1）∶（2）（1）∶（3）（3）∶（4）0.750 0.004 0.007

圖1 KN93對(duì)C2C12GLUT4myc骨骼肌CaMKⅡ磷酸化的影響

3 討論

胰島素刺激GLUT4從胞漿的儲(chǔ)存囊泡（GLUT4囊泡）轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜上轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞，從而促進(jìn)骨骼肌攝取葡萄糖。運(yùn)動(dòng)時(shí)肌肉收縮是另一個(gè)重要的生理性刺激，促進(jìn)GLUT4轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜[4]。本研究采用Cch孵育C2C12骨骼肌細(xì)胞，模擬運(yùn)動(dòng)的作用，通過測(cè)定C2C12 GLUT4myc小鼠骨骼肌細(xì)胞膜上GLUT4myc的水平和CaMKⅡ的磷酸化，探討CaMKⅡ在收縮刺激骨骼肌細(xì)胞GLUT4myc轉(zhuǎn)位機(jī)制中的作用。

Cch通過激活乙酰膽堿受體和繼發(fā)的Na+的流入，誘導(dǎo)間接去極化，動(dòng)作電位改變二氫吡啶受體的構(gòu)象，開放肌漿網(wǎng)Ca2+釋放通道，將Ca2+釋放入胞漿，Ca2+濃度升高從而觸發(fā)收縮[5]。筆者的前期工作顯示Cch能快速升高骨骼肌細(xì)胞胞漿Ca2+濃度[3]。肌肉收縮導(dǎo)致細(xì)胞GLUT4轉(zhuǎn)位的信號(hào)機(jī)制還不明確，但可以確定的是Ca2+信號(hào)和腺苷一磷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是收縮促進(jìn)骨骼肌攝取葡萄糖的兩個(gè)重要的信號(hào)機(jī)制[6-7]。

C2C12骨骼肌細(xì)胞表達(dá)CaMKⅡ，本研究顯示Cch顯著增加細(xì)胞膜上的GLUT4myc水平和CaMKⅡ的磷酸化水平，表明Cch促進(jìn)GLUT4myc轉(zhuǎn)位并激活CaMKⅡ。抑制CaMKⅡ的磷酸化可抑制Cch增加的細(xì)胞膜上GLUT4myc水平，提示CaMKⅡ介導(dǎo)收縮促進(jìn)GLUT4myc轉(zhuǎn)位的作用。GLUT4處于由胞漿向胞膜外排并由胞膜內(nèi)吞進(jìn)入胞漿的動(dòng)態(tài)平衡中，降低GLUT4的內(nèi)吞或加快GLUT4的外排均可導(dǎo)致細(xì)胞膜上的GLUT4數(shù)量增加。胰島素促進(jìn)骨骼肌葡萄糖攝取主要通過增加GLUT4外排。另外胞漿Ca2+濃度升高，可促進(jìn)大鼠骨骼肌L6細(xì)胞中GLUT4的外排，并抑制其內(nèi)吞，增加骨骼肌葡萄糖的攝取，亦由CaMKⅡ介導(dǎo)。而收縮如何調(diào)節(jié)GLUT4的運(yùn)輸，CaMKⅡ在其中的作用如何則有待進(jìn)一步研究。

糖尿病患者存在胰島素分泌障礙和作用缺陷，而收縮可促進(jìn)骨骼肌攝取葡萄糖，具有胰島素替代作用，運(yùn)動(dòng)對(duì)血糖調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用。因此研究闡明運(yùn)動(dòng)/肌肉收縮調(diào)節(jié)GLUT4轉(zhuǎn)位和葡萄糖攝取的機(jī)制有助于改善胰島素抵抗、預(yù)防和治療糖尿病。

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