張君勝，王 揚(yáng)，楊曉志，張 力

（江蘇畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，江蘇 泰州 225300）

蘇氨酸（Threonine）是僅次于蛋氨酸、賴氨酸和色氨酸的第4種限制性氨基酸，在醫(yī)藥和畜牧業(yè)中有非常重要的作用[1]。近年來(lái)隨著人們對(duì)于蘇氨酸需求量的日益增加，蘇氨酸生產(chǎn)的研究也日益成為了熱點(diǎn)。目前，發(fā)酵法以其生產(chǎn)成本低、資源節(jié)約、環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)逐漸成為工業(yè)化生產(chǎn)L-蘇氨酸的主要方式。

在谷氨酸棒桿菌代謝過(guò)程中，葡萄糖經(jīng)糖酵解途徑生成磷酸烯醇式丙酮酸，磷酸烯醇式丙酮酸經(jīng)二氧化碳固定反應(yīng)生成四碳二羧酸，經(jīng)氨基化反應(yīng)生成天冬氨酸；天冬氨酸在天冬氨酸激酶催化作用下，生成天冬氨酸半醛；天冬氨酸半醛在高絲氨酸脫氫酶的催化下生成高絲氨酸；高絲氨酸在高絲氨酸激酶的催化下生成蘇氨酸[2-3]。在微生物發(fā)酵合成L-蘇氨酸的整個(gè)代謝途徑中，高絲氨酸脫氫酶和天冬氨酸激酶控制著整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中碳源和氮源的走向，它們是決定能否獲得高產(chǎn)L-蘇氨酸的關(guān)鍵酶[4]。筆者采用誘變選育的一系列谷氨酸棒狀桿菌菌株，測(cè)定其高絲氨酸脫氫酶和天冬氨酸激酶兩個(gè)關(guān)鍵酶的活性，研究了谷氨酸棒桿菌兩個(gè)關(guān)鍵酶與發(fā)酵產(chǎn)L-蘇氨酸的關(guān)系，并對(duì)比了誘變處理前后酶活的大小，旨在從更深入的代謝途徑研究L-蘇氨酸產(chǎn)量提高的原因，為L(zhǎng)-蘇氨酸的育種工作提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種 谷氨酸棒狀桿菌（Cornebacterium glutamicum）：WS4006、WS4006-1（L-Met-）、D-6（LMet-+L-Lys-）、K-11（L-Met-+L-Lys-+AHVr）、Y-1（L-Met-+L-Lys-+AHVr+Ile-），全部由筆者實(shí)驗(yàn)室誘變獲得[5]。

1.1.2 試 劑 L-天冬氨酸、5-三磷酸腺苷二鈉鹽（ATP）、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷、S-2-氨基乙基半胱氨酸、β-巰基乙醇、三羥甲基氨基甲烷、氯代三苯基四氮唑均為上海生工產(chǎn)品；2，3，5-氯化三苯基四唑（即TTC）為Sigma公司產(chǎn)品；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 培養(yǎng)基的配制參照文獻(xiàn)[5]。

1.2 方 法

1.2.1 高絲氨酸脫氫酶活性的測(cè)定方法 高絲氨酸脫氫酶活性測(cè)定參照文獻(xiàn)[6]略有改動(dòng)，通過(guò)測(cè)定人造受氫體為2，3，5-氯化三苯基四唑（即TTC）的脫氫酶活性來(lái)反映高絲氨酸脫氫酶活性。將谷氨酸棒狀桿菌在肉湯培養(yǎng)基中，30℃，180 r/min培養(yǎng)9 h，使其全部達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)其酶活性最高。將培養(yǎng)好的新鮮菌液，5 000 r/min離心4min，棄去上清液，加蒸餾水洗滌，搖勻，4 000 r/min離心5 min，棄去上清液（反復(fù)3次）。取等體積蒸餾水將菌體配成懸液待用。取若干25mL比色管，分別加入7.5mL Tris-HCl緩沖液、2.5mL 0.4%的TTC溶液、2.5mL 0.36%的Na2CO3溶液和2.5mL純水，并混合均勻。將比色管置于37℃恒溫水浴鍋中振蕩5 min。加入5mL粗酶液以0.5mL甲醛作為空白對(duì)照。37℃恒溫水浴鍋培養(yǎng)一段時(shí)間后，加入人造受氫體TTC，TTC在細(xì)胞呼吸過(guò)程中接受氫以后，其還原產(chǎn)物三苯基甲膳（即TF）以紅色結(jié)晶存在于細(xì)胞內(nèi)，開始顯色，記下顯色時(shí)間。當(dāng)培養(yǎng)達(dá)到一定時(shí)間后（一般2 h），加入甲醛作為終止劑，混合均勻，即可終止反應(yīng)。用5mL 80%丙酮萃取TF，在波長(zhǎng)485 nm處測(cè)出吸光度值。吸光度的大小就反映了高絲氨酸脫氫酶活性的大小。把1 h產(chǎn)生1μg TF的量作為一個(gè)酶活力單位。根據(jù)所測(cè)得的吸光度值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線找TTC-脫氫酶活性，就是高絲氨酸脫氫酶的活性。

1.2.2 天冬氨酸激酶（AKI）活性的測(cè)定 天冬氨酸激酶（AKI）的活性測(cè)定參照文獻(xiàn)[7]略有改動(dòng)。將活化后的谷氨酸棒狀桿菌于30℃搖床培養(yǎng)9 h，使其達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后加入ITPG（終濃度1 mmol/mL）。4 h后收集菌體，6 000 r/min 離心 10min，棄上清液，把菌體懸浮于0.02 mol/L，pH 7.5，含0.03 mol/Lβ-巰基乙醇的冷凍磷酸鉀緩沖液中，超聲破碎后的懸濁液15 000 r/min離心30min，取上清液作為粗酶液。取粗酶液50μL加入到1mL反應(yīng)液（底物為L(zhǎng)-天冬氨酸10 mmol/L，Tris-HCl緩沖液（pH 8.1）94 mmol/L，ATP 10.4 mmol/L，MgSO41.6 mmol/L，β-巰基乙醇 10 mmol/L，NH4OH 800 mmol/L，KCl 800mmol/L）中。反應(yīng)體系混合均勻后，在30℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)30 min后，加入0.5 mL 12%三氯乙酸中止反應(yīng)。加入0.5mL 3mml/LHCl和 0.5mL FeCl3·6H2O(溶于 0.1mmo1/LHCl中)?；旌衔?00 r/min離心5 min去沉淀，上清液在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)光密度，以反應(yīng)液中不加L-天冬氨酸為對(duì)照。AKI的測(cè)活由在600 nm下反應(yīng)液的吸光度的大小決定。OD600即為天冬氨酸異羥酸離子的光學(xué)密度，酶活則表示為：1 000×OD600值。

2 結(jié)果與分析

2.1 TTC標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取8支20mL的帶有塞子的試管，在試管中依次加入 Tirs-HCl 2 mL，蒸餾水2 mL，TTC系列溶液2mL，對(duì)照管中不加TTC，然后再各試管中加入10%Na2S 1mL，充分震蕩顯色后，加入甲醛5 mL，萃取3 min，取上層有機(jī)溶液在分光光度計(jì)485 nm處比色測(cè)定吸光度。所繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 TTC脫氫酶活性標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

由圖1可以看出TTC脫氫酶活性（TTC-DHA）與吸光度A的關(guān)系，得回歸曲線公式：

y表示吸光度A值，x表示TTC脫氫酶活性，R2表示回歸系數(shù)。

2.2 基因突變對(duì)谷氨酸棒狀桿菌高絲氨酸脫氫酶活性的影響

將谷氨酸棒狀桿菌 WS4006、WS4006-1、D-6、K-11、Y-1分別經(jīng)過(guò)菌液的培養(yǎng)后，用分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度A值，每個(gè)測(cè)定做3個(gè)重復(fù)，其吸光度A值如表1所示。

表1 各菌株高絲氨酸脫氫酶的活性

從表1可以看出，選育出的目的菌株隨著遺傳特性的增多，其吸光度A值也逐漸增大。將這些數(shù)據(jù)代入回歸方程1可以得到各個(gè)目的菌株的TTC濃度。原始菌株WS4006脫氫酶的活性很低，0.124 9 U，隨著缺陷型菌株和AHV抗性的選育，其脫氫酶的活性也隨之增高，從WS4006、WS4006-1、D-6、K-11 到 Y-1，高絲氨酸脫氫酶的活 性 由 0.124 9、0.179 3、0.220 0、0.395 6 U 到0.416 0 U，分別是出發(fā)菌株的 1.44、1.76、3.17、3.33倍，與此相對(duì)應(yīng)L-蘇氨酸產(chǎn)量由0.31 g/L提高到1.04、1.21、2.43、4.35 g/L，分別是出發(fā)菌株的 3.35、3.90、7.84、14.03倍。由此可見，酶活性提高相對(duì)應(yīng)L-蘇氨酸產(chǎn)量也提高。

2.3 基因突變對(duì)谷氨酸棒狀桿菌天冬氨酸激酶活性的影響

谷氨酸棒狀桿菌的目的菌株，經(jīng)過(guò)細(xì)胞破碎后提取粗酶液，模擬底物和反應(yīng)體系后，在分光光度計(jì)600 nm處測(cè)定光密度。具體結(jié)果見表2。

表2 各菌株天冬氨酸激酶的活性

原始菌種天冬氨酸激酶的活性只有23.6 U，隨著菌種選育工作的進(jìn)行，天冬氨酸激酶的活性也逐漸提高，從 WS4006、D-6、K-11 到菌株 Y-1，酶活已經(jīng)由24 U達(dá)到39 U，天冬氨酸激酶的活性分別是出發(fā)的原始菌株的 1.17、1.25、1.5、1.65 倍。其中，抗性菌株K-11天冬氨酸激酶活性增幅最大，主要是由于解除了蘇氨酸對(duì)天冬氨酸激酶的反饋抑制作用。與L-蘇氨酸合成相對(duì)應(yīng)，可見天冬氨酸激酶活性提高有利于L-蘇氨酸的合成。

3 討 論

本試驗(yàn)中蛋氨酸缺陷型菌株WS4006-1的選出，解除了蛋氨酸對(duì)高絲氨酸脫氫酶的反饋?zhàn)瓒糇饔?，使高絲氨酸脫氫酶的活性有了一定的提高，但提高不明顯。沈瓊等[7]在研究蘇氨酸操縱子的克隆表達(dá)與天冬氨酸激酶的測(cè)活時(shí)，用分子方法克隆得到thr操縱子，將結(jié)構(gòu)基因裝載于pET-lla質(zhì)粒上的T7啟動(dòng)子下游，得到了表達(dá)質(zhì)粒pTHlla-08，經(jīng)測(cè)定天冬氨酸激酶的活性為含載體質(zhì)粒pET-lla的對(duì)照菌的100倍，但L-蘇氨酸產(chǎn)量并沒(méi)有大量提高[8]。這與本試驗(yàn)結(jié)論，天冬氨酸激酶活性提高不明顯有很大出入，但L-蘇氨酸產(chǎn)量提高不明顯結(jié)果相似。另外李敬坡等[9]研究發(fā)現(xiàn)賴氨酸和甲硫氨酸對(duì)天冬氨酸激酶活性沒(méi)有抑制作用，當(dāng)蘇氨酸濃度大于0.5mmol/L時(shí)，對(duì)其活性有明顯抑制作用，并且抑制作用與蘇氨酸呈現(xiàn)濃度依賴性。張雪等[10]經(jīng)5 L發(fā)酵罐發(fā)酵產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)，攜帶含蘇氨酸操縱子質(zhì)粒的W3110菌株L2蘇氨酸產(chǎn)量為2.590 g/L，質(zhì)粒上thr A解除反饋抑制后，L-蘇氨酸的產(chǎn)量增加到9.223 g/L。此兩人研究結(jié)果與本研究相近，由此可見，蘇氨酸反饋抑制不解除的情況下，提高天冬氨酸激酶活性和L-蘇氨酸產(chǎn)量幾乎是不可能的。另外解除蛋氨酸時(shí)高絲氨酸脫氫酶的反饋抑制作用沒(méi)有完全解除，因?yàn)楦呓z氨酸脫氫酶除了蛋氨酸的反饋?zhàn)瓒糇饔猛膺€受到L-蘇氨酸本身的反饋抑制。饒志明等[11]在研究谷氨酸棒狀桿菌高絲氨酸脫氫酶編碼基因hom的敲除來(lái)提高L-賴氨酸產(chǎn)量時(shí)，發(fā)現(xiàn)賴氨酸產(chǎn)量也沒(méi)有明顯提高，這也與本試驗(yàn)結(jié)果類似?？赡茉蚴浅霭l(fā)菌為原始菌種，沒(méi)有經(jīng)過(guò)突變育種改造，影響到了氨基酸產(chǎn)量。

賴氨酸缺陷型D-6（L-Met-+L-Lys-）的選育從一定程度上減弱了L-賴氨酸對(duì)于天冬氨酸激酶的反饋抑制作用，使得天冬氨酸激酶活性由原來(lái)的23.6 U提高到29.8 U，提高不明顯，可能與L-蘇氨酸自身對(duì)于天冬氨酸激酶的反饋抑制有很大關(guān)系。蘇氨酸的結(jié)構(gòu)類似物AHV的選育，一方面可以解除蘇氨酸自身對(duì)于天冬氨酸激酶的反饋抑制，另一方面也解除了對(duì)高絲氨酸脫氫酶的反饋抑制，使得這兩個(gè)酶的活性都有了很大提高。從表2也可以看出，這一步高絲氨酸脫氫酶和天冬氨酸激酶的活性提高最為明顯。雖然如此，但L-蘇氨酸產(chǎn)量仍然沒(méi)有大幅提高，可能是抗性育種試驗(yàn)不夠徹底，沒(méi)有能夠從根本上解除其自身的反饋抑制作用。

最后選育L-異亮氨酸，是為了不讓積累的L-蘇氨酸進(jìn)一步流失，原理上對(duì)天冬氨酸激酶和高絲氨酸脫氫酶的活性沒(méi)有影響，甚至由于分支代謝被切斷，有可能間接抑制他們的活性。Hua等[12]曾報(bào)道能夠過(guò)量表達(dá)天冬氨酸激酶的重組菌在合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)，賴氨酸產(chǎn)量提高，但生長(zhǎng)受到影響(減弱)；Jetten等[13]的研究結(jié)果與其相似。而Koffas等[14]的工作表明重組菌不能在以葡萄糖為碳源的合成培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。Koffas等認(rèn)為這可能是由于較高的天冬氨酸激酶活性與回補(bǔ)途徑中回補(bǔ)酶的活性不平衡造成的。

谷氨酸棒桿菌是氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)的主要菌株，也是氨基酸發(fā)酵的模式菌株。本研究對(duì)谷氨酸棒桿菌的發(fā)酵產(chǎn)L-蘇氨酸和兩個(gè)關(guān)鍵酶活性的關(guān)系進(jìn)行了研究，由結(jié)果可以看出，這兩種關(guān)鍵酶的活性還是有了一定的提高。本研究對(duì)利用谷氨酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-蘇氨酸菌株的選育具有一定的指導(dǎo)意義。

[1] DebabovV G.The threonine story[J].Adv Biochem Eng Biotechno，2003，79：113-136.

[2]陳殿林.微生物工程技術(shù)原理 [M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2007.

[3] 張克旭，陳 寧，張 蓓，等.代謝控制發(fā)酵[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，1998.

[4]Thierbach G，Halinoswski J，Bachmann B.Cloning of a DNA fragment from Corynebacterium glutamicum conferring aminoethyl cysteine resistance and feedback resistance to aspartokinase[J].Appl Microbiol Biotechnol，1990，32：443-448.

[5] 王 揚(yáng)，張 力，李偉星，等.亞硝基胍誘變選育L-蘇氨酸高產(chǎn)菌的研究[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（4）：107-109.

[6] 趙 智，劉陽(yáng)劍，王 宇，等.抗反饋抑制的天冬氨酸激酶基因在鈍齒棒桿菌中的表達(dá)[J].微生物學(xué)報(bào)，2005，8（45）：4，530-533.

[7] 沈 瓊，黃雪峰，吳海珍，等.蘇氨酸操縱子的克隆表達(dá)及天冬氨酸激酶的測(cè)活[J].藥物生物技術(shù)，2003，10（3）：133-136.

[8] 天津輕工業(yè)學(xué)院.氨基酸工藝學(xué)[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，1983.

[9] 李敬坡，韓宏巖，夏 勇，等.極端嗜熱菌Thermus thermophilus HB27中天冬氨酸激酶在大腸桿菌中表達(dá)、純化及酶學(xué)性質(zhì)研究[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2009，40（4）：479-483.

[10]張 雪，閆繼愛，于 雷，等.含蘇氨酸操縱子重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其對(duì)大腸桿菌L-蘇氨酸積累的影響 [J].微生物學(xué)報(bào)，2009，49（5）：592-597.

[11]饒志明，沈 微，張君勝，等.谷氨酸棒桿菌高絲氨酸脫氫酶編碼基因 hom 的敲除[J].中國(guó)生物工程雜志，2007，27（1）：59-63.

[12]Qiang H，Chen Y，Kazuyuki S.Metabolic control analysis for lysine synthesis using Corynebacterium glutamicum and experimental verification[J].Biosci Bioeng，2000，90（2）：184-192.

[13]Jetten M.Follettie M.Sinskey A.Effect of different levels of aspartokinase on the lysine production of Corynebacterium lactofermentum[J].Appl Microbiol Biotechnol，1995，41：76-821.

[14]KoffasM A，Jung GY，StephanopoulosG.Engineeringmetabolism and product formation in Corynebacterium glutamicum by coordinated gene overexpression[J].Metab Eng，2003，5（1）：32-41.