陳 超，陳 寧，覃 霞，朱 樑

第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)征醫(yī)院消化內(nèi)科，上海200003

肝星狀細(xì)胞(HSC)是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)［1］。HSC可由靜息狀態(tài)活化為成纖維細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞外膠原的沉積，在肝纖維化及肝腫瘤的發(fā)生發(fā)展中到重要的作用;同時(shí)，可能作為一種具有多向分化潛能的祖細(xì)胞［2］，成為肝病研究中的一個(gè)焦點(diǎn)。因此，分離原代肝星狀細(xì)胞是肝纖維化研究的重要基礎(chǔ)工作之一。酶原位灌注消化法和密度梯度離心法兩步法是分離HSC最為常用的分離方法［3-5］。HSC胞漿內(nèi)含有兩類VitA的“脂滴”:Ⅰ類“脂滴”靠近胞膜，直徑約2 μm;Ⅱ類“脂滴”靠近胞核，直徑約8 μm［6］。由于“脂滴”的存在，HSC在細(xì)胞密度上要小于肝細(xì)胞。因而，在進(jìn)行密度梯度離心時(shí)，HSC產(chǎn)生一定的浮力，可以與其他肝內(nèi)細(xì)胞分離開(kāi)。但是，HSC分離難度大，成功率并不高。不少實(shí)驗(yàn)者即使在酶原位灌注消化效果較好的情況下仍然不能分離得到純度和產(chǎn)量較高的HSC，因此百思不得其解。筆者經(jīng)過(guò)近百次原代大鼠HSC分離實(shí)驗(yàn)，采取多重多次密度梯度離心法改良了肝星狀細(xì)胞分離方法，有效避免HSC分離過(guò)程中由于操作誤差及HSC本身特征所導(dǎo)致的細(xì)胞流失，最大程度減小了在酶原位灌注消化效果較好的情況下HSC得率和純度仍較低的發(fā)生幾率，HSC得率和純度更加穩(wěn)定，達(dá)到國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道水平，為肝纖維化的研究奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠，體質(zhì)量400～500 g，購(gòu)自第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。普通飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食及飲水。

1．2 主要試劑 鏈酶蛋白酶(Pronase E)，德國(guó)Merck公司產(chǎn)品;Ⅳ型膠原酶(Collagenase typeⅣ)，Gibco公司產(chǎn)品;DNA酶Ⅰ(DnaseⅠ)，Bio basic公司產(chǎn)品;Nycordenz，挪威Axis-Shield公司產(chǎn)品;DMEM、胎牛血清為美國(guó)Hyclone產(chǎn)品。

1．3 分離和培養(yǎng)用溶液

1．3．1 前灌注液:NaCl 8 g，KCl 0．4 g，KH2PO40．06 g，NaHCO30．35 g，酚紅0．02 g，加超純水至終體積1 000 mL，pH=7．4。

1．3．2 酶配制液:NaCl 8 g，KCl 0．4 g，CaCl20．56 g，Na2HPO4·12H2O 0．151 g，NaH2PO4·2H2O 0．078 g，HePes 2．38 g，NaHCO30．35 g，酚紅0．006 g，加超純水至終體積1 000 mL，pH=7．2。

1．3．3 含鈣GBSS液:KCl 0．37 g，CaCl20．2251 g，MgCl2·6H2O 0．21 g，MgSO40．0342 g，KH2PO40．03 g，NaHCO32．27 g，NaH2PO40．1196 g，葡萄糖1．0 g，加超純水至終體積1 000 mL，pH=7．3。

1．3．4 Pronase E灌注溶液:Pronase E 140～150 mg，酶配制液100 mL。

1．3．5 Collagenase typeⅣ灌注溶液:Collagenase typeⅣ30 mg，酶配制液100 mL。

1．3．6 DnaseⅠ溶液:DnaseⅠ 7 mg，酶配制液25 mL。

1．3．7 后分散液:Pronase E 10 mg，酶配制液80 mL。1．3．8 28．7%Nycordenz分離液:Nycordenz 28．7 g，含鈣GBSS 100 mL。

1．4方法

1．4．1 改良的HSC分離方法(多重多次密度梯度離心法):乙醚吸入麻醉大鼠后以7%水合氯醛0．45 mL/ 100 g腹腔注射麻醉大鼠，背位固定大鼠，常規(guī)消毒鋪巾;暴露門靜脈、胃冠狀靜脈，門靜脈下置兩根4號(hào)絲線;結(jié)扎門靜脈遠(yuǎn)端并行門靜脈穿刺，置管并結(jié)扎;開(kāi)啟恒流泵，以15 mL/min灌注37℃浴熱的D-Hank’s液，迅速用顯微血管鉗阻斷胃冠狀靜脈，待肝臟稍變色，迅速剪開(kāi)下腔靜脈，直至肝臟變?yōu)橥咙S色;以8 mL/min依次灌注37℃浴熱的Pronase E灌注溶液、Collagenase typeⅣ灌注溶液。分離并剪碎肝臟，倒入三角燒瓶?jī)?nèi)，加入后分散液約80 mL與DNaseⅠ液8 mL，37℃振蕩消化25 min。取出消化液，經(jīng)200目尼龍網(wǎng)濾過(guò)，將濾液在4℃中以760×g離心7 min。棄上清，DMEM培養(yǎng)液第二次清洗離心(760×g離心7 min);棄上清，4℃中以50×g離心3 min;棄細(xì)胞沉淀，上清4℃中以760×g離心7 min;棄上清，用28．7%的Nycodenz+DNaseⅠ液2 mL+DMEM 2 mL調(diào)成密度約1．040～1．050 g/mL細(xì)胞懸液裝于15 mL無(wú)菌離心管內(nèi)，小心上鋪少許GBSS液;20℃下行零加減速度密度梯度離心(1 350×g離心18 min)。離心結(jié)束后取界面處細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)液離心清洗1次(760×g離心7 min)，在含20%FBS的DMEM中混勻并接種10 cm培養(yǎng)皿;取第一次密度梯度離心后的離心管，將細(xì)胞沉淀混勻后以760×g重新離心7 min，棄上清，用28．7%的Nycodenz+DNaseⅠ液2 mL+DMEM 2 mL調(diào)成密度約1．050～1．060 g/mL細(xì)胞懸液裝于15 mL無(wú)菌離心管內(nèi)再次密度梯度離心，離心結(jié)束后取界面處細(xì)胞清洗并接種于培養(yǎng)皿中。

1．4．2 HSC性質(zhì)及純度的鑒定:①臺(tái)盼藍(lán)染色方法鑒定細(xì)胞活性:0．4%臺(tái)盼藍(lán)溶液10 μL加入至90 μL細(xì)胞懸液中，混勻，光鏡下未著色者為活細(xì)胞。②HSC性質(zhì)鑒定:328 nm紫外光激發(fā)HSC自發(fā)熒光，鑒定HSC性質(zhì)。③Desmin細(xì)胞免疫熒光方法鑒定及檢測(cè)HSC純度、α-SMA細(xì)胞免疫熒光方法檢測(cè)HSC靜息和活化狀態(tài):4℃預(yù)冷PBS緩沖液洗細(xì)胞爬片2 min×2次，4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS緩沖液洗5 min×2次;含0．03%Triton-X100的PBS室溫孵育30 min，室溫PBS緩沖液洗5 min×3次;3%羊(或兔)血清室溫下孵育1 h封閉非特異性抗原;封閉液稀釋的一抗(α-SMA，1∶100;Desmin，1∶50)4℃孵育過(guò)夜;室溫PBS緩沖液洗5 min×3次，PBS稀釋相對(duì)應(yīng)的熒光二抗(1∶100)避光室溫孵育20 min;室溫PBS緩沖液洗5 min×3次，DAPI復(fù)染細(xì)胞核，熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2．1 細(xì)胞形態(tài)觀察 剛分離的HSC為折光性很強(qiáng)的小圓細(xì)胞，形態(tài)均一，遠(yuǎn)小于肝細(xì)胞;體外培養(yǎng)2 d后HSC大多貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)呈橢圓形，光鏡下可見(jiàn)脂肪顆粒;體外培養(yǎng)7 d后HSC脂滴消失，胞漿開(kāi)始伸展，胞體變得細(xì)長(zhǎng);培養(yǎng)14 d后HSC胞漿完全伸展，內(nèi)可見(jiàn)平行排列的細(xì)胞骨架(見(jiàn)圖1)。

2．2 HSC得率、性質(zhì)及純度鑒定 本實(shí)驗(yàn)采取酶原位灌注消化法和多重多次密度梯度離心方法，每只正常SD大鼠HSC得率為(3～5)×107個(gè)，減少了在HSC密度梯度離心過(guò)程中因操作誤差及HSC自身密度相對(duì)不均一性而造成的細(xì)胞流失，較單重單次密度梯度離心方法分離HSC產(chǎn)量及純度更高、更穩(wěn)定。臺(tái)盼藍(lán)拒染顯示HSC活率95%以上，328 nm紫外光激發(fā)HSC自發(fā)藍(lán)綠色熒光(見(jiàn)圖2)，Desmin和α-SMA細(xì)胞免疫熒光方法顯示靜息HSC(體外培養(yǎng)2 d)胞漿內(nèi)Desmin表達(dá)陽(yáng)性，所有細(xì)胞核著藍(lán)色，細(xì)胞純度90%以上，靜息HSC胞漿內(nèi)α-SMA表達(dá)陰性;活化HSC(體外培養(yǎng)14 d)胞漿內(nèi)Desmin表達(dá)陽(yáng)性，活化HSC胞漿內(nèi)α-SMA表達(dá)陽(yáng)性，細(xì)胞純度幾乎100% (見(jiàn)圖3、圖4)。

3 討論

肝星狀細(xì)胞的分離是肝纖維化機(jī)制研究的關(guān)鍵，也是難點(diǎn)。在正常肝臟內(nèi)，肝星狀細(xì)胞占肝細(xì)胞總數(shù)的5%，分布在Disse間隙的血竇周邊，長(zhǎng)長(zhǎng)的樹(shù)突環(huán)繞于肝板之間的血竇中。肝星狀細(xì)胞富含脂滴使其密度最輕，且易與肝細(xì)胞吸附。目前最常用的肝星狀細(xì)胞分離方法多采用酶原位灌注消化法和密度梯度離心相結(jié)合的兩步法:利用酶消化肝細(xì)胞、分散肝星狀細(xì)胞，再以密度梯度離心、純化HSC。肝星狀細(xì)胞的分離有兩大關(guān)鍵步驟:一是肝臟充分消化。肝臟充分消化的前提是肝臟在酶灌注前血液沖洗的干凈與否。二是準(zhǔn)確配制密度梯度分離液。然而，不少實(shí)驗(yàn)者在肝星狀細(xì)胞分離過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，有時(shí)在酶原位灌注消化極為理想的情況下，HSC分離的產(chǎn)量和純度仍不理想，白白耗費(fèi)了大量時(shí)間、精力及金錢，卻仍百思不得其解。筆者根據(jù)近百次分離肝星狀細(xì)胞的經(jīng)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，原因很可能出在密度梯度分離液的配制上。目前國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)多推薦密度梯度分離液的密度調(diào)為1．053 g/mL。然而，根據(jù)此密度進(jìn)行分離HSC時(shí)有時(shí)卻會(huì)發(fā)現(xiàn)HSC產(chǎn)量和純度極低。究其原因，筆者認(rèn)為有以下兩點(diǎn):其一，在密度梯度分離液實(shí)際配制過(guò)程中，微小的操作誤差即能引起密度極大的變化。這在單次單重密度梯度離心尤為明顯;其二，以1．053 g/mL密度梯度離心分離HSC后，仍有不少數(shù)量HSC存在于廢棄的細(xì)胞沉淀中。筆者在數(shù)十次分離 HSC的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在1．040～1．060 g/mL密度范圍內(nèi)進(jìn)行多次多重密度梯度離心分離HSC將有效解決上述兩種原因所導(dǎo)致的HSC產(chǎn)量和純度低下的問(wèn)題。在1．040～1．060 g/mL范圍內(nèi)配制多重密度離心，降低了單次操作的誤差幾率，在不影響HSC分離純度的基礎(chǔ)上，將HSC分離過(guò)程中因操作誤差導(dǎo)致細(xì)胞丟失減小到最低程度。同時(shí)，相比單重密度(1．053 g/mL)梯度離心法，多重多次密度梯度離心能將細(xì)胞沉淀中尚存的HSC盡可能多地分離出來(lái)，大大提高HSC產(chǎn)量而未影響HSC純度。單次單重密度(1．053 g/mL)梯度離心分離HSC后細(xì)胞沉淀中仍存在較多數(shù)量HSC，筆者認(rèn)為可能有兩方面原因:一是肝內(nèi)HSC存在不同亞群，其密度雖接近但相對(duì)不均一。因此，在以單重單次密度梯度離心分離HSC時(shí)只有部分HSC能夠被分離出來(lái)，而在一定范圍內(nèi)采取多次多重密度梯度離心則能得到更多HSC;二是HSC與死去的肝細(xì)胞粘連在一起，在單次單重密度離心時(shí)未被分離出來(lái)，而多次多重離心可能再次分散HSC對(duì)肝細(xì)胞的粘連而被分離出來(lái)。

綜上，筆者建議采取酶原位灌注消化法和多重多次密度梯度離心結(jié)合的方法分離肝星狀細(xì)胞提高細(xì)胞產(chǎn)量及純度。密度配制以1．040～1．060 g/mL范圍內(nèi)為宜。另外，體外分離細(xì)胞時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，否則將影響細(xì)胞的活性，因此，筆者建議多重多次密度離心以2～3次離心密度梯度離心為宜。

［1］Gressner AM，Weiskirchen R．Modern pathogenetic concepts of liver fibrosis suggest stellate cells and TGF-β as major players and therapeutic targets［J］．J Cell Mol Med，2006，10(1):76-99．

［2］Kordes C，Sawitza I，Müller-Marbach A，et al．CD133+hepatic stellate cells are progenitor cells［J］．Biochem Biophys Res Commun，2007，352(2):410-417．

［3］ Friedman SL，Roll FJ．Isolation and culture of hepatic lipocytes，Kupffer cells，and sinusoidal endothelial cells by density gradient centrifugation with Stractan［J］．Anal Biochem，1987，161(1): 207-218．

［4］ Ramm GA．Isolation and culture of rat hepatic stellate cells［J］．J Gastroenterol Hepatol，1998，13(8):846-851．

［5］Knook DL，Seffelaar AM，de Leeuw AM．Fat-storing cells of the rat liver．Their isolation and purification［J］．Exp Cell Res，1982，139 (2):468-471．

［6］Hendriks HF，Verhoofstad WA，Broower A，et al．Perisinusoidal fatstoring cells are the main vitamin A storage sites in rat liver［J］．Exp Cell Res，1985，160(1):138-149．