李 娟，張 君，張 毓

（1.天津醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，天津300070；2.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部免疫學(xué)系，北京100191）

Aire（autoimmune regulator）是一種自身免疫調(diào)節(jié)因子，其基因發(fā)現(xiàn)于1997年，由于Aire基因突變導(dǎo)致自身免疫性多內(nèi)分泌病變-念珠菌病-外胚層營養(yǎng)不良（autoimmune polyendocri-nopathy candidiasis and ectodermal dystrophy，APECED），近幾年引起人們的廣泛關(guān)注。Aire基因主要表達(dá)于胸腺、淋巴結(jié)和脾臟，研究表明Aire通過誘導(dǎo)外周組織抗原（PTAs）在胸腺髓質(zhì)上皮細(xì)胞中的表達(dá)促進(jìn)自身反應(yīng)性胸腺細(xì)胞的克隆清除，從而建立中樞耐受[1]。我們發(fā)現(xiàn)RelB缺陷小鼠和Aire缺陷小鼠中均存在CD4單陽性（single positive，SP）胸腺細(xì)胞發(fā)育缺陷[2]，并且有研究表明RelB缺陷小鼠中Aire的表達(dá)顯著減少[3]，這些結(jié)果均提示Aire對SP胸腺細(xì)胞的最終成熟可能發(fā)揮重要作用。MigR1質(zhì)粒是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，該載體多克隆位點MCS后加入內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點IRES和綠色熒光蛋白GFP序列；逆轉(zhuǎn)錄病毒感染宿主細(xì)胞的范圍較為廣泛，且外源目的基因易整合入宿主細(xì)胞基因組，表達(dá)長期穩(wěn)定[4]。本研究擬在MigR1的多克隆位點處插入小鼠Aire基因的ORF序列，構(gòu)建能夠穩(wěn)定表達(dá)Aire蛋白的重組質(zhì)粒，收集逆轉(zhuǎn)錄病毒上清，感染胸腺基質(zhì)細(xì)胞系，為進(jìn)一步研究Aire的生物學(xué)功能作準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 293T細(xì)胞，MTEC9(小鼠胸腺基質(zhì)細(xì)胞系，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部免疫學(xué)系T細(xì)胞研究室建立)。

1.1.2 質(zhì)粒與菌株 MigR1逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒、pHIT123質(zhì)粒（編碼鼠白血病病毒包膜蛋白）、pCGP質(zhì)粒（編碼鼠白血病病毒gag/pol）由陳友海教授（U－ niversity of Philadelphia,USA）贈予；DH-5α感受態(tài)細(xì)菌由本室保存。

1.1.3 主要試劑 TRIzol?試劑購自Gibco BRL公司；Taq DNA聚合酶購自天為時代生物技術(shù)有限責(zé)任公司；BglII、XhoI等限制性內(nèi)切酶、Pfu DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Wizard Plus質(zhì)粒提取試劑盒、CIAP（Calf Intestinal Alkaline Phosphatase）、NBT/ BCIP底物均購自Promega公司；質(zhì)粒大量提取純化試劑盒購自北京威格拉斯生物技術(shù)有限公司；Jet－PEITM轉(zhuǎn)染試劑盒購自Polyplus公司；凝膠回收試劑盒（QIAEX II Gel Extraction System）購自Qiagen公司；anti-FLAG mAb、AP（堿性磷酸酶）-anti-rabbit-IgG購自Promega公司；anti-Aire多克隆抗體購自Upstate公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 Aire ORF擴(kuò)增 利用Gene Runner軟件分析Aire的核苷酸序列，在ORF兩側(cè)設(shè)計兩條引物:上游引物：5’-GGG ATG GAA TGC TAC GCC-3’；下游引物：5’-TCA GGA AGA GAA GGG TGG TG-3’。以新鮮分離的小鼠胸腺基質(zhì)細(xì)胞的cDNA為模板，Taq DNA聚合酶-Pfu DNA聚合酶聯(lián)合使用進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增aire全長ORF（94℃5min，94℃30s，55℃45s，72℃90s，72℃7min，共35個循環(huán)）。1.0%瓊脂糖凝膠電泳確定目的片段。

1.2.2 Aire基因的克隆 利用QIAEX II Gel Extraction Kit凝膠回收并純化目的片段，取純化后產(chǎn)物5.0μL，加入10×PCR buffer1.0μL，dNTP 0.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，無菌水3.0μL，混勻后72℃20min。取加A尾后的產(chǎn)物3.0μL加入2× rapid ligation buffer 5.0μL，pGEM-Teasy1.0μL和T4DNA ligase1.0μL，4℃連接過夜。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH-5α感受態(tài)細(xì)菌，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑取8～10個白色單克隆細(xì)菌，LA液體培養(yǎng)基振搖培養(yǎng)過夜，PCR鑒定（用克隆Aire ORF全長的引物），選取表達(dá)Aire的陽性克隆細(xì)菌，測序(北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司)。將測序正確的陽性克隆菌液提取質(zhì)粒備用。

1.2.3 Aire逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

1.2.3.1 BglII酶切位點的加入：在上下游引物的5’端分別合成BglII酶切位點，并在下游引物中加入FLAG標(biāo)簽，便于構(gòu)建表達(dá)后的檢測。

以1.2.2中提取的質(zhì)粒為模板，使用Pfu DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，94℃5min，94℃30s，60℃45s，72℃90s，72℃7min，共35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物膠回收、純化、測序如前面所述。

1.2.3.2 MigR1質(zhì)粒的單酶切以及去磷酸化：用BglII單酶切MigR1質(zhì)粒(37℃，3～4h)，凝膠回收酶切后的MigR1片段。取酶切后MigR115.0μL，加入10×buffer 5.0μL，0.01U/μL CIAP 5.0μL，無菌水25.0μL，37℃反應(yīng)30min，在反應(yīng)體系中再加入5μL 0.01U/μL CIAP，37℃，30min。使用QIAEX II Gel Extraction Kit將去磷酸化的產(chǎn)物立即進(jìn)行脫鹽和濃縮。

1.2.3.3 T-easy-Aire重組質(zhì)粒的單酶切：用BglII單酶切T-easy-Aire重組質(zhì)粒（37℃，3～4h），電泳，膠回收。

1.2.3.4 MigR1-Aire重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定：將酶切后T-easy-Aire 7.0μL和去磷酸化后MigR11.0μL混合，加入10×ligation buffer 1.0μL和T4DNA ligase1.0μL，4℃連接過夜。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH-5α感受態(tài)細(xì)菌，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑取10個白色單克隆細(xì)菌，LA液體培養(yǎng)基振搖培養(yǎng)過夜，提質(zhì)粒，用BglII和XhoI進(jìn)行酶切鑒定（BglII鑒定是否連接成功，XhoI鑒定連接方向是否正確），保存正向連接的菌種和質(zhì)粒。選擇正向連接的質(zhì)粒，使用JetPEITM轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48h后熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。裂解細(xì)胞，Western blot檢測Aire蛋白的表達(dá)。

1.2.4 逆轉(zhuǎn)錄病毒上清的收集 在10cm培養(yǎng)皿中接種包裝細(xì)胞293T，細(xì)胞匯合度約20%，24h后將培養(yǎng)基替換為37℃預(yù)溫的無血清DMEM，每孔10mL，在孵箱中放置10～30min；配制如下反應(yīng)混合液：逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒DNA 10μg，pHIT123質(zhì)粒10μg，pCGP質(zhì)粒10μg，2.5mol/L CaCl250μL，加無菌水補至500μL；將此混合液緩慢旋轉(zhuǎn)加入500μL 2×HBS中，吹泡混勻，室溫孵育30min；輕輕滴加至6孔板中，輕搖培養(yǎng)板混勻，37℃靜置；5h后將培養(yǎng)孔中的液體換為37℃預(yù)溫的DMEM-10%NCS，5～6mL/孔。48h后，收集上清，用0.45μm的濾器過濾或者1500r/min離心5min，獲得的上清中含有短暫產(chǎn)生的病毒，將病毒上清分裝，-70℃儲存。

1.2.5 逆轉(zhuǎn)錄病毒上清體外感染胸腺基質(zhì)細(xì)胞系

提前12～24h在6孔板中接種胸腺基質(zhì)細(xì)胞系(大約2×105/孔)；配制DMEM-10%NCS與polybrene (終濃度4μg/mL)的混合液；將6孔板中的培養(yǎng)基移去，在各孔中分別加入上述混合液與病毒上清（總體積2mL，可加入不同比例體積的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清，但其體積應(yīng)小于或等于感染混合液終體積的1/2），2500r/min離心90min；37℃孵育24h后將孔中液體更換為DMEM-10%NCS；48h后，用0.05%EDTA消化細(xì)胞，重懸在BSS-2%NCS中，制成單細(xì)胞懸液，F(xiàn)ACS無菌分選GFP+細(xì)胞。裂解細(xì)胞，用anti-Aire polyclonal antibody進(jìn)行Western blot檢測。

2 結(jié)果

2.1 Aire ORF片段的獲取 小鼠Aire基因全長1936bp，Gene Runner分析其ORF為58-1716，編碼產(chǎn)物約60kDa。通過PCR擴(kuò)增，得到約1.65kb的擴(kuò)增片段（圖1）。

圖1 Aire ORF的擴(kuò)增Fig 1 Amplification of Aire ORF

利用Gene Runner軟件分析Aire基因的限制性酶切位點，未能找到適合的限制性酶切位點以便構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)質(zhì)粒，因此我們設(shè)計了含BglII酶切位點的引物，并在下游引物中加入FLAG標(biāo)簽，便于構(gòu)建表達(dá)后的檢測。以Aire ORF為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到含BglII酶切位點以及FLAG標(biāo)簽的Aire片段（Aire-BglII）（圖2）。

圖2 含BglII酶切位點及FLAG標(biāo)簽的Aire的擴(kuò)增Fig 2 Amplification of Aire with BglII restriction enzyme cutting site and FLAG tag

2.2 Aire逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的構(gòu)建 經(jīng)BglII酶切鑒定連接成功。用Gene Runner軟件分析Aire序列的限制性位點，發(fā)現(xiàn)在473位有XhoI位點，若為正向連接，XhoI酶切后的小片段應(yīng)在1243bp左右，若為反向連接，XhoI酶切后的小片段應(yīng)在416bp左右。結(jié)果顯示挑取的9個陽性克隆均連接成功，但是只有5個為正向連接（圖3）。

選取正向連接的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48h后熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率約45%～50%（圖4）。

利用anti-FLAG mAb進(jìn)行Western blot檢測，結(jié)果顯示在60kDa左右有條帶（圖5），證明構(gòu)建的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)質(zhì)粒能夠成功表達(dá)Aire蛋白。

圖3 MigR1-Aire酶切鑒定Fig 3 Verification of recombinant MigR1-Aire by restriction enzyme digestion

圖4 轉(zhuǎn)染后293T細(xì)胞的GFP表達(dá)Fig 4 The expression of GFP of 293T cells after transfection

圖5 Western blot鑒定Aire蛋白的表達(dá)Fig 5 Western blot analysis of Aire protein

構(gòu)建的MigR1-Aire示意圖見圖6。

圖6 構(gòu)建的MigR1-Aire示意圖Fig 6 Sketch map of the recombinant plasmid MigR1-Aire

2.3 Aire蛋白在MTEC9細(xì)胞內(nèi)強(qiáng)制性表達(dá) 用質(zhì)粒MigR1-Aire及MigR1轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞系293T細(xì)胞，收集病毒上清感染MTEC9，流式細(xì)胞儀檢測GFP的表達(dá)，感染效率約30%～35%（圖7）。

圖7 逆轉(zhuǎn)錄病毒上清感染MTEC9的效率檢測Fig 7 The efficiency of infection with retroviral supernatant in MTEC9

MTEC9-Aire的裂解產(chǎn)物經(jīng)抗體雜交后在60kDa左右出現(xiàn)條帶，而MTEC9-MOCK則沒有，表明Aire蛋白在MTEC9細(xì)胞內(nèi)表達(dá)成功（圖8）。

圖8 Aire在MTEC9中的表達(dá)檢測Fig 8 WesternblotanalysisofAireproteininMTEC9afterinfection

3 討論

胸腺內(nèi)T淋巴細(xì)胞的發(fā)育受到復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)控，目前對于調(diào)控DN/DP/SP這幾個階段的轉(zhuǎn)換及其中一些重要事件（如陽性選擇、陰性選擇等）的分子機(jī)制已有很多報道，但是關(guān)于SP胸腺細(xì)胞在髓質(zhì)區(qū)分化過程的分子調(diào)控機(jī)制仍缺乏詳細(xì)闡述。

我們對RelB缺陷小鼠和Aire缺陷小鼠的研究提示Aire在CD4SP胸腺細(xì)胞的最終成熟階段可能發(fā)揮關(guān)鍵作用[2]。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，Aire除了能夠通過誘導(dǎo)PTAs的表達(dá)誘導(dǎo)中樞免疫耐受，還能通過參與調(diào)節(jié)胸腺髓質(zhì)上皮細(xì)胞（medullary thymic epithelial cells,mTECs）的分化及功能的其它多方面來誘導(dǎo)中樞免疫耐受，如調(diào)節(jié)某些參與抗原提呈及處理的分子[5-6]，調(diào)節(jié)mTECs的分化[7-8]，調(diào)節(jié)mTECs中趨化因子CCR4和CCR7配體的表達(dá)[9]等。Aire究竟通過何種機(jī)制影響胸腺細(xì)胞的終末分化？要闡明此機(jī)制，構(gòu)建能夠融合表達(dá)GFP和Aire蛋白的表達(dá)質(zhì)粒是非常有必要的。

我們可以分離Aire缺陷小鼠的mTECs，將其與正常小鼠來源的SP1細(xì)胞共育，檢測其能否支持SP3向SP4的轉(zhuǎn)化；若不能支持，我們將使用本研究中構(gòu)建的Aire逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體，在Aire缺陷小鼠的mTECs中強(qiáng)制性表達(dá)Aire，觀察能否糾正此缺陷。我們曾試圖找到表達(dá)Aire的胸腺基質(zhì)細(xì)胞系，但是在多株小鼠胸腺基質(zhì)細(xì)胞系中并沒有找到表達(dá)Aire的細(xì)胞系。本研究利用收集的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清感染胸腺基質(zhì)細(xì)胞系MTEC9，在該細(xì)胞系中成功表達(dá)Aire，為進(jìn)一步研究Aire的強(qiáng)制性表達(dá)對胸腺基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)SP胸腺細(xì)胞分化功能的影響奠定了基礎(chǔ)。

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