金長江，鄭先哲

（東北農業(yè)大學工程學院，哈爾濱 150030）

黑加侖（Black currant.L），學名黑穗醋栗，是新興的第三代小漿果，其果實營養(yǎng)價值和經濟價值較高，其中維生素C、花青素、果糖、果酸含量較高，是影響黑加侖內部品質的重要因素。目前我國對小漿果品質的檢測、分級仍然停留在人工水平上，檢測速度慢[1-2]。

近紅外光譜檢測技術是隨著化學計量學發(fā)展而開拓出來的一個新應用領域，目前大約有四十多個國家和地區(qū)開展近紅外光譜檢測技術的研究和應用[3]。近紅外光譜檢測的漿果對象主要有蘋果、梨、桃子、柑桔類、草莓、李子、葡萄、香蕉和芒果等果樹種類，光譜檢測方式主要以漫反射和透射為主[4]，但很少有應用近紅外光譜方法快速檢測黑加侖營養(yǎng)成分的研究報道。本研究以黑加侖為研究對象，以維生素C、花青素、果糖、果酸四種營養(yǎng)成分含量為考察指標，采用近紅外技術，探究一種簡捷、快速、高效的檢測方法。本研究對于小漿果優(yōu)良品種的選育推廣，改善生產、加工企業(yè)產品質量控制，提高市場競爭力，從而促進我國黑加侖產業(yè)的經濟效益具有較大現實意義和理論價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗所用黑加侖由東北農業(yè)大學園藝實驗站提供，選取代表性的樣品50個，其中40個作為校正集樣品，另外10個作為預測集樣品，二者比例為4∶1。

酚酞、乙醇、氫氧化鈉、草酸、抗壞血酸、2,6-二氯靛酚鈉、碳酸氫鈉、蒽酮、葡萄糖、濃硫酸均為分析純，由天津市福辰化學試劑廠生產；兒茶素標準品（Catechin），純度大于99%，由上海工碩生物技術有限公司提供。

1.2 試驗儀器

試驗所用主要設備為近紅外臺式谷物、食品、乳制品分析儀（ZX-888，由奧斯博國際有限公司生產，美國），測試方法為漫透射，掃描速度可達35次·s-1，配有透射檢測器、采樣系統(tǒng)以及ZX-888 Calibration Software近紅外定量分析軟件。本試驗所用其他儀器:DK-98-IIA型數顯恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；ARRW60型電子精密天平（上海奧豪斯公司）；DL-5低速離心機（上海安亭科學儀器廠）；UV757CRT紫外-可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 近紅外光譜采集[5]

將樣品依次編號，用打漿機將樣品打成漿狀，再放入勻漿機中勻漿30 s，最后放入試樣杯中，在ZX-888近紅外臺式谷物、食品、乳制品分析儀上進行光譜測定，樣品池為光程為13 mm的石英試樣杯，波長范圍918～1045 nm，分辨率為8 cm-1，每個樣品掃描3次，取平均值，所得光譜數據以文本的形式存入計算機內。

1.3.2 化學測定

與光譜測定時間相同，用化學方法測出每一個樣品對應的總酸、維生素C、總糖和花青素含量。總酸測定采用NaOH滴定法（GB/T12456-90），以蘋果酸計；維生素C測定采用2,6-二氯靛酚滴定法；總糖采用蒽酮比色法；花青素含量測定[6]:配制兒茶素標準溶液，濃度為1.2 mg·mL-1，分別取1、2、3、4、5mL，定容至10mL。再各取1mL，分別加入5mL顯色劑。在500nm波長下，測定其吸光度，以吸光度為縱坐標，花青素濃度為橫坐標繪制標準曲線，取1～2 g黑加侖果漿，加入10mL甲醇，震蕩 20 min，3000 r·min-1離心 20 min，取上清液1mL，顯色分析，由標準曲線可算出樣品中原花青素含量。

1.4 化學計量學方法的選擇[7-12]

采用多元線性回歸（MLR）、主成分回歸分析（PCA）、偏最小二乘法（PLS）三種方法通過校正集樣品光譜和測得的化學值建立校正模型，然后用預測集樣品對模型進行驗證，考察其預測結果與化學值的一致性。

1.5 數據處理

用ZX-888 Calibration Software近紅外定量分析軟件和基于matlab7.0軟件的自編程序對試驗數據進行處理，采用多元線性回歸（MLR）、主成分回歸分析（PCA）、偏最小二乘法（PLS）三種統(tǒng)計方法對校正集樣品中總酸、維生素C、總糖、花青素含量與近紅外光譜吸收值之間進行回歸，選擇最佳校正數學模型。評價校正模型的預測性能和可靠性由決定系數（R2）、校正標準偏差（RMSEC）、預測標準偏差（RMSEP）來進行[4]。

式中，n校正集樣本數；yi為第i個樣品的預測值；yi為第i個樣品的化學值（真值）；ym為樣本真值的平均值；P為回歸因子數目，試驗中選P為12；N為預測集樣本數；yNi為第Ni個樣品的預測值；yNi為第Ni個樣品的化學值（真實值）。

2 結果與分析

2.1 花青素含量標準曲線

花青素標準曲線如圖1所示。

回歸方程為:y=1.609x+0.006；相關系數為:R2=0.9929。由圖1可知，吸光度A與花青素濃度有良好的線性關系，可用作測定黑加侖中花青素含量。

圖1 花青素的標準曲線Fig.1 Standard curve of anthocyanin

2.2 校正集和預測集樣品的分布特征

校正集和預測集樣品的分布特征如表1所示。

2.3 黑加侖果漿近紅外漫透射光譜分析

不同營養(yǎng)成分黑加侖果漿近紅外漫透射光譜如彩版Ⅰ所示。

本試驗對每個樣品采集12個波長點處的吸光度值，波長點分別為918、928、940、950、968、975、985、998、1010、1023、1037 和 1045 nm，波長間隔在10nm左右。彩版Ⅰ所繪光譜圖是40個校正集樣品在這12個波長點處吸光度值的折線圖。從彩版Ⅰ中可知，雖然40個樣品營養(yǎng)成分含量明顯不同，但它們的大部分圖譜卻十分相似。光譜圖中，圖譜在零線左右基本呈對稱分布，在975 nm附近出現1個較強的吸收，建模所需的光譜信息較易被識別。從基團的近紅外吸收角度分析[4-5]，1666～2500nm主要為水分子羥基組合頻峰，740～1080nm主要為C-H、O-H基團的三級和四級倍頻峰，而黑加侖中的有機酸、糖類、維生素C、花青素含有大量的以上基團以及酚類和醇類羥基，故918～1045 nm波段范圍基本能夠覆蓋所研究營養(yǎng)成分的近紅外光譜信息，并能排除水的干擾。

表1 校正集和預測集樣品的分布特征Table1 Calibration sets and prediction set sample distribution

2.4 不同數學處理方法的比較

表2是校正集樣品近紅外漫透射光譜吸光度及營養(yǎng)成分含量化學值數據，表4是預測集樣品近紅外漫透射光譜吸光度及營養(yǎng)成分含量化學值數據。其中 x1、x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、x9、x10、x11、 x12分 別 為 樣 品 在 波 長 點 918、 928、 940、950、968、975、985、998、1010、1023、1037和1045 nm處的光譜吸收值，y1、y2、y3、y4表示樣品的總酸含量化學測定值（%）、維生素C含量化學測定值（mg·100 g-1）、總糖含量化學測定值（%）、花青素含量化學測定值（mg·100 g-1）。

分別用近紅外定量分析軟件（ZX-888 Calibration Software）對以上數據進行多元線性回歸、用matlab程序對以上數據進行主成分回歸分析、偏最小二乘回歸，得到40份校正集漿液樣品中總酸、維生素C、總糖、花青素含量與近紅外光譜吸收值之間的預測方程（程序見附錄），預測方程的評價結果見表5。R2越大，RMSEC、RMSEP越小說明模型準確性越好。

由表4可知，總酸模型MLR、PCA算法的決定系數（R2）分別為0.9097、0.8691，校正標準偏差（RMSEC）分別為0.3324、0.4003，預測標準偏差（RMSEP）分別為0.1129、0.4998，可見兩個總酸模型的R2都大于0.8，RMSEC、RMSEP都較小，均符合模型應用要求；而總酸模型的PLS算法的決定系數只有0.2088，嚴重偏小，且RMSEC、RMSEP都較大，分別為0.9840、0.6405，因此PLS算法不適合對總酸建模，其原因主要是自變量間多重線性關系不明顯。維生素C模型MLR算法的決定系數（R2）為0.8826，校正標準偏差（RMSEC）、預測標準偏差（RMSEP）分別為13.4896、2.5210，可以作為預測維生素C含量的校正模型；而維生素C模型的PCA、PLS算法的決定系數（R2）分別為 0.7429、0.5694，小于0.8，且RMSEC較大，分別為19.9647、25.8376，RMSEP也較大，分別為14.5588、14.5541，不可選。總糖模型MLR、PCA算法的決定系數（R2）分別為0.9662、0.8156，校正標準偏差（RMSEC）分別為0.1923、0.7839，預測標準偏差（RMSEP）分別為0.1307、0.8787，兩個總糖模型的R2都大于0.8，但RMSEC、RMSEP前者較小，后者較大，因此前者較符合模型應用要求；而總糖模型的PLS算法的決定系數為0.6740，偏小，且RMSEC、RMSEP都較大，分別為1.0422、0.6147，因此PLS算法不適合對總糖建模?；ㄇ嗨啬Ｐ蚆LR、PCA、PLS算法的決定系數（R2）分別為0.9488、0.9804、0.8027，校正標準偏差（RMSEC）分別為22.8507、14.1208、44.8465，預測標準偏差（RMSEP）分別為39.5303、8.4196、29.3958，可見三個花青素模型的R2都符合要求，但只有PCA算法RMSEC、RMSEP較小，符合模型應用要求，而花青素模型的MLR、PLS算法的RMSEC、RMSEP都太大，不適合對花青素建模。

表2 校正集樣品近紅外漫透射光譜吸光值及營養(yǎng)成分含量化學值數據（部分數據）Table2 Calibration-set samples NIR spectral absorbency and nutritional content value data

表4 不同回歸方法得到預測方程的評價結果Table4 Different return method obtains forecast equation measure results

綜合上述分析，用多元線性回歸建立的總酸、維生素C、總糖含量的數學模型最好，用主成分回歸分析建立的花青素含量的數學模型最好。

2.5 預測方程擬合質量的檢驗

經2.2討論得到的最優(yōu)預測方程為（1）～（4）:

將預測集樣本在各波長點處的吸光值代入以上相應的預測方程可得到每個樣本的預測值，結果如圖2～5，各圖表示了預測集樣品預測值與真值的相關系數和殘差。

圖2 總酸預測值與真值的關系Fig.2 Total acid predicted values and the true value of the relationship

圖3 VC預測值與真值的關系Fig.3 VC predicted value and true value relational

由圖2～5可知，從分布上看，四個數學模型的殘差分布比較均勻，10個預測樣品總酸、維生素C、總糖和花青素的殘差之和分別為-0.39、6.75、-0.43、3.75，相對誤差接近0；總酸、維生素C、總糖和花青素的預測相關系數分別為0.9892、0.9912、0.9963、0.9829，相關性較高，可以滿足實際要求。

圖4 總糖預測值與真值的關系Fig.4 Total sugar predicted values and the true value of the relationship

圖5 花青素預測值與真值的關系Fig.5 Anthocyanin predicted values and the true value of the relationship

3 討論

在近紅外區(qū)，主要是含氫基團如C-H、O-H、N-H等基團的分子振動的倍頻、合頻。由于吸收較弱，分子的倍頻、合頻的組合方式復雜多樣，譜帶寬，沒有銳峰，大量的是重疊譜峰，特別是黑加侖中的有機酸、糖類、維生素C、花青素都含有大量的C-H、O-H基團，常常出現重疊的譜圖，也就是說每一波長點的吸光值都有可能是這四種有機物吸收的共同結果，因而很難精確歸屬近紅外光譜帶。對這些復雜有機物的光譜分析，需要利用其在全波長的信息（918～1045 nm），運用化學計量學方法進行研究。由于不同基團產生的光譜在吸收峰位、強度上不同，隨著樣品組成的變化其光譜特征也將發(fā)生變化，根據測定黑加侖樣品的近紅外光譜與它們的組成數據，通過合理的光譜處理及校正方法，可以建立樣品光譜與組成間的校正模型。

從模型優(yōu)化的數據可知，選擇不同的回歸方法對模型檢驗的R2值、RMSEC值、RMSEP值存在很大差異，對于黑加侖果漿樣品，選擇合適的波長和數學處理方法，才能得到高質量的黑加侖營養(yǎng)成分測定的預測模型。通過對多元線性回歸（MLR）、主成分回歸分析（PCA）、偏最小二乘法（PLS）三種建模方法對比分析得出:用多元線性回歸建立的數學模型更適合預測總酸、維生素C、總糖的含量，用主成分回歸分析建立的數學模型更適合預測花青素的含量。

4 結論

從殘差和預測相關系數分析可得出:經優(yōu)化的4個數學模型預測效果較好，該方法對同時快速定量分析黑加侖多組分含量是可行的，可以在實踐中應用和推廣。

[1]徐雅琴,邵鐵華,付紅.黑穗醋栗(布勞德)葉片中黃酮類物質抗氧化性研究[J].東北農業(yè)大學學報,2003,34(2):196-198.

[2]王業(yè)成,陳海濤,付威.黑加侖物理力學特性研究[J].東北農業(yè)大學學報,2009,40(3):110-114.

[3]劉燕德.水果糖度和酸度的近紅外光譜無損檢測研究[D].杭州:浙江大學,2006:11-12.

[4]涂潤林.基于光物性的鴨梨黑心病無損檢測方法的研究[D].北京:中國農業(yè)大學,2004:106-115

[5]劉振堯,楊季冬.短波近紅外光譜法同時測定分析水中麥芽糖、乳糖和蔗糖[J].光譜實驗室,2009,26(5):1311

[6]李春陽,許時嬰,王璋.香草醛-鹽酸法測定葡萄籽、梗中原花青素含量的研究[J].食品科學,2004,25(2):157-160.

[7]嚴衍祿,趙龍蓮,韓東海,等.近紅外光譜分析基礎與應用[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,2005:32,44-78,172-173.

[8]陳雪英,李頁瑞,陳勇,等.近紅外光譜快速測定紅花逆流提取過程中羥基紅花黃色素A的含量[J].分析化學,2009,37(10):1451-1456.

[9]Cen H,He Y.Theory and application of near infrared reflectance spectroscopy in determination of food quality[J].Trends in Food Science and Technology,2007,18(2):72-83.

[10]Jin S,Chen H.Near-infrared analysis of the chemical composition of rice straw[J].Industrial Crops and Products,2007,26(2):207-211.

[11]Saftner R,Polashock J,Ehlenfeldt M.Instrumental and sensory quality characteristics of blueberry fruit from twelve cultivars[J].Postharvest Biology and Technology,2008,49:19-26.

[12]Shao Y and He Y.Nondestructive measurement of acidity of strawberry using VIS/NIR spectroscopy[J].International Journal of Food Properties,2008(11):102-111.