吳 瑕，邵 輝，王 鑫，張?zhí)m威

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)成棟學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江龍丹乳業(yè)有限公司，哈爾濱 150046；3.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與遺傳工程研究院，哈爾濱 150001）

抗生素在畜牧業(yè)的廣泛應(yīng)用，不可避免地造成牛乳中的抗生素殘留。具有β-內(nèi)酰胺環(huán)的抗生素如青霉素G、阿莫西林、氨芐青霉素等在奶牛養(yǎng)殖業(yè)中常用于治療奶牛乳房炎，由于其廉價和廣譜的抗菌性而被大量且頻繁地超劑量使用，因此導(dǎo)致了牛乳中高濃度的β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留。牛乳中抗生素殘留的原因主要是非治療目的用藥、治療目的用藥和非法人為摻雜[1]。

對抗生素有過敏體制的人服用抗生素殘留的牛乳后，會發(fā)生過敏反應(yīng)如皮疹、過敏性休克等[2]。李銀生曾報道，英國一對青霉素高度敏感的病人，使用含約10 IU·mL-1的青霉素的商品牛乳后，發(fā)生了變態(tài)反應(yīng)[3]。長期飲用則會抑制人體腸道中敏感菌群的生長，并會導(dǎo)致人體對抗生素產(chǎn)生耐藥性，給臨床治療帶來不可估量的麻煩[4]。從乳品加工的角度看，原料乳中抗生素殘留嚴(yán)重影響干酪、黃油、發(fā)酵乳的起酵和后期風(fēng)味的形成[4-6]。因此，牛乳中的β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留一直是各國政府和食品安全機(jī)構(gòu)關(guān)注的重點。WHO和歐盟法典規(guī)定的青霉素G在牛乳中的最大殘留限制（MRL）為4μg·kg-1，F(xiàn)DA規(guī)定的最大檢出量為5μg·kg-1[7]。

用于檢測牛乳中青霉素G殘留的方法，目前國內(nèi)主要依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.27-94進(jìn)行，此方法操作簡單，比較適合基層單位使用，但其靈敏度低，對乳中青霉素G的檢測限僅為0.04 U·mL-1，已不適應(yīng)國際需要。國外已研制出檢測牛乳中β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留的各種類型的試劑盒，如以微生物受阻法為原理的Delvotest試劑盒、免疫受體檢測試劑盒如SNAP試劑盒等，但因受到使用成本、操作難易程度、對主要設(shè)備要求以及供貨連續(xù)性等眾多因素的影響，還沒有在我國得以廣泛推廣[8]。

試管擴(kuò)散法是以微生物受阻法為基本原理，用嗜熱脂肪芽孢桿菌作為指示菌，在培養(yǎng)基中加入指示劑，當(dāng)牛乳中無抗生素殘留時，嗜熱脂肪芽孢桿菌在牛乳中生長產(chǎn)酸使指示劑變色；若牛乳中有抗生素殘留，則嗜熱脂肪芽孢桿菌的生長受到抑制，指示劑保持紫色不變。依據(jù)這一現(xiàn)象，確定牛乳中β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留。本研究的目的是比較試管擴(kuò)散法同TTC法（GB4789.27-94）的優(yōu)劣，從而確定試管擴(kuò)散法在實際應(yīng)用中的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株

嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus，Bs）（中科院微生物研究所）。

1.1.2 主要培養(yǎng)基

胰蛋白胨大豆（瓊脂），平板計數(shù)瓊脂。

1.1.3 主要試劑及原料

青霉素G、氨芐青霉素、苯唑青霉素（新青霉素Ⅱ）、頭孢吡啉（頭孢菌素Ⅷ）、氯霉素、甲氧芐氨嘧啶（美國SIGma公司）；羥氨芐青霉素（阿莫西林）、頭孢氨芐（先鋒霉素Ⅳ）（國家藥檢所）；苯基丁氮酮（法國Vetam公司）；脫脂乳粉和全脂無抗乳粉（購于國家乳品檢測中心）；溴甲酚紫、TTC（天津科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心）；SNAP試劑盒（龍丹乳品公司）。

1.2 方法

1.2.1 試驗用不含抗生素的牛乳

無抗牛乳:由無抗全脂奶粉復(fù)原而成，濃度為10%（W/V），并用SNAP試劑盒檢測以確定其是無抗生素殘留牛乳樣品。

1.2.2 抗生素殘留奶樣的制備

將抗生素貯備液與經(jīng)過檢測證明無抗生素殘留的奶樣混合制成濃度為0.25×MRL、0.5×MRL、1.0×MRL、1.5×MRL和2.0×MRL五個濃度的抗生素殘留奶樣。

1.2.3 Bs菌液的制備

把標(biāo)準(zhǔn)菌株嗜熱脂肪芽孢桿菌保存于胰蛋白胨大豆瓊脂斜面，每3周轉(zhuǎn)種1次。以下面方法制備芽孢懸液:接種芽孢培養(yǎng)基，于64±2℃培養(yǎng)，當(dāng)80%芽孢形成時（一般需72 h）即可停止培養(yǎng)，取出培養(yǎng)液離心，5000 r·min-1離心15 min，傾去上清夜，再次把細(xì)胞懸浮于滅菌生理鹽水中并再次離心，如此反復(fù)洗滌，最后把洗滌過的芽孢懸浮于30mL滅菌生理鹽水中，并于4℃保存。芽孢懸液能保存6～8個月。用準(zhǔn)備好的試驗平皿定期檢查活力。制備好的芽孢懸液采用生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，選取適當(dāng)稀釋度涂布于平板計數(shù)培養(yǎng)基上，55℃24 h培養(yǎng)后，用標(biāo)準(zhǔn)平板計數(shù)方法計算，應(yīng)達(dá)到107cfu·mL-1。

1.2.4 試管擴(kuò)散法檢測過程

檢測時檢測培養(yǎng)基分裝到18 mm×180 mm的試管中，待用，檢測前，先將受檢乳樣80℃處理2 min，冷卻到室溫后加入苯甲基丁氮酮，吸取待檢樣品加到已裝有培養(yǎng)基的試管中，然后將加入了受檢乳樣的試管經(jīng)70℃水浴10 min后放入63℃水浴中，檢測時用無抗生素殘留牛乳作為陰性對照，陽性對照濃度為2.5×MRL。結(jié)果判斷的時間以陰性對照由紫色變?yōu)辄S色的時間為準(zhǔn)。試管擴(kuò)散法檢測6種β-內(nèi)酰胺類抗生素，每個濃度重復(fù)30次，得到試驗結(jié)果的確定依據(jù)顯色判斷標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

1.2.5 TTC法操作步驟

按照GB4789.27-94操作。本試驗采用TTC法檢測6種β-內(nèi)酰胺類抗生素時，每個濃度重復(fù)4次，每次做2個平行。

1.2.6 實測結(jié)果分析

由牛奶收購站及市場采集鮮牛乳樣品70份，同時用試管擴(kuò)散法、TTC法進(jìn)行對比測試，為了進(jìn)一步證實，同時采用SNAP檢測試劑盒進(jìn)行驗證。比較三種方法進(jìn)行檢測得到的陽性率，從而比較試管擴(kuò)散法和TTC法在實際應(yīng)用中的優(yōu)劣。

表1 試管法結(jié)果判斷顏色依據(jù)Table1 Colour judgement basis of results by tube diffusion test

2 結(jié)果與分析

2.1 試管擴(kuò)散法檢測6種β-內(nèi)酰胺類抗生素

試管擴(kuò)散法檢測6種β-內(nèi)酰胺類抗生素得到的結(jié)果見彩版Ⅰ。

彩版Ⅰ中1號與2號試管培養(yǎng)基變?yōu)辄S色表示結(jié)果為陰性，3號試管變?yōu)辄S紫色表示結(jié)果為可疑，4號和5號兩個試管變?yōu)樽仙硎窘Y(jié)果為陽性，6號試管為未添加奶樣的檢測培養(yǎng)基。由彩版Ⅰ可以看出，檢測結(jié)果的顏色梯度較為明顯。符合表1中試管擴(kuò)散法結(jié)果判斷依據(jù)中對顏色的規(guī)定。

2.2 試管擴(kuò)散法檢測6種β-內(nèi)酰胺類抗生素的檢測限

檢測時，每個濃度重復(fù)30次，結(jié)果見表2。

由表2可以看出，試管擴(kuò)散法檢測6種β-內(nèi)酰胺類抗生素可以達(dá)到1.0×MRL的殘留濃度，對于0.5×MRL殘留濃度的檢測上，頭孢氨芐不能檢出，其他5種抗生素陽性檢出率不足90%，因此試管擴(kuò)散法檢測6種β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留的檢測限為1.0×MRL，符合歐盟法典規(guī)定的牛乳中6種β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留的最大殘留限制（MRL）[7]。

表2 試管擴(kuò)散法檢測6種β-內(nèi)酰胺類抗生素得到的結(jié)果（n=30）Table2 Results of testing 6 kinds of β-lactam antibiotics by test tube method(n=30)

2.3 用TTC法檢測6種β-內(nèi)酰胺類抗生素的檢測限

用TTC法檢測6種藥物殘留的結(jié)果如表3所示。

2.4 試管擴(kuò)散法實際應(yīng)用情況結(jié)果分析

由牛奶收購站及市場采集鮮牛乳樣品70份，同時用試管擴(kuò)散方法和TTC法進(jìn)行對比試驗，為了進(jìn)一步證實結(jié)果的可靠性，同時采用SNAP分析方法進(jìn)行驗證。用3種方法測試得到的陽性率如表4所示，具體的分析結(jié)果如表5、6和7所示。

表3 試管擴(kuò)散法和TTC法檢測6種藥物殘留的結(jié)果（n=4）Table3 Residue results of 6 kinds of drug by the tube diffusion test and TTC(n=4)

表4 70份牛乳樣品檢驗結(jié)果Table4 Detecting results of 70 milk samples

表5 試管擴(kuò)散法和SNAP試劑盒檢測結(jié)果比較Table5 Comparison of the detecting results between test tube diffusion and SNAP method

表6 試管擴(kuò)散法和TTC法檢測結(jié)果比較Table6 Comparison of the detecting results between test tube diffusion and TTC method

表7 TTC法和SNAP試劑盒檢測結(jié)果比較Table7 Comparison of the detecting results between TTC and SNAP method

由表5可以看出，試管擴(kuò)散法和SNAP檢測法具有較高的一致性。試管擴(kuò)散法檢測為陽性的14份樣品，經(jīng)SNAP試劑盒檢測結(jié)果也為陽性，而試管擴(kuò)散法檢測為陰性的5份樣品經(jīng)SNAP試劑盒檢測結(jié)果為陽性，原因可能是奶樣中藥物殘留的濃度接近SNAP法的檢測限（青霉素G3.5μg·kg-1，頭孢吡啉3.5μg·kg-1）但是低于試管擴(kuò)散法的檢測限（青霉素G:4μg·kg-1頭孢吡啉，頭孢吡啉:60μg·kg-1）。用試管擴(kuò)散法檢測為陽性的3份樣品經(jīng)SNAP法檢測為陰性，原因可能是奶樣中藥物殘留的濃度高于試管擴(kuò)散法的檢測限（氨芐青霉素和羥氨芐青霉素的檢測限為4μg·kg-1）但低于SNAP法的檢測限（氨芐青霉素的檢測限為8.2μg·kg-1，羥氨芐青霉素檢測限為8μg·kg-1）。

由表6可以看出，經(jīng)試管擴(kuò)散法檢測為陽性的17份樣品，經(jīng)TTC法檢測只有4份為陽性，其余結(jié)果均為陰性，原因是TTC法檢測為陽性的樣品殘留濃度較高，而TTC法檢測為陰性的樣品殘留濃度低于TTC法的檢測限但高于試管擴(kuò)散法的檢測限（1.0×MRL），因此TTC法在檢測限上已經(jīng)不符合國際要求了。表7也說明了這個問題，由SNAP法檢測為陽性的19份樣品，TTC法只檢出了4份陽性，其余15份則檢測為陰性，從SNAP的讀數(shù)儀上可以看出TTC法檢出的15份陰性樣品顯示的數(shù)值較大，即殘留的濃度較高，因此說明TTC法已不適應(yīng)現(xiàn)實需要了。

3 討 論

從檢測限上比較，試管擴(kuò)散法能夠檢測β-內(nèi)酰胺類抗生素中的多種抗生素殘留，檢測限符合國際標(biāo)準(zhǔn)1.0×MRL，而TTC法檢測青霉素G殘留的檢測限已不符合國際標(biāo)準(zhǔn)，而對于β-內(nèi)酰胺類抗生素中除青霉素G以外的其他抗生素殘留的檢測未作說明，經(jīng)本試驗檢測，TTC法不能檢出等于或低于國際標(biāo)準(zhǔn)1.0×MRL的β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留；試管擴(kuò)散法同AOAC認(rèn)證的方法SNAP試劑盒具有較高的一致性，說明試管擴(kuò)散法可以進(jìn)一步開發(fā)為檢測牛乳中β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留的商業(yè)方法。從檢測時間上比較，TTC法檢測時間至少3.5 h，而試管擴(kuò)散法檢測時間為3 h 10 min；雖然有所縮短，但程度不大，這也是試管擴(kuò)散法存在的不足。接下來的研究工作將從縮短試管擴(kuò)散法的檢測時間入手，可嘗試通過誘變育種篩選出產(chǎn)酸時間較短的嗜熱脂肪芽孢桿菌，或者將微生物法和免疫受體法結(jié)合起來等研究方法，以達(dá)到縮短檢測時間的目的。

4 結(jié)論

研究結(jié)果表明，用試管擴(kuò)散法檢測牛乳中的β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留有一定的研究意義，較之于其他微生物方法，該方法操作簡單易于掌握，不需要特殊儀器，且靈敏度能夠達(dá)到國際要求；與國際認(rèn)證的標(biāo)準(zhǔn)方法具有較好的協(xié)同性。唯一不足的，也是關(guān)鍵就是試管擴(kuò)散法與國際上商業(yè)檢測方法比，檢測時間偏長為3 h 10 min，相信在進(jìn)一步研究后，此方法可應(yīng)用于牛乳中青霉素G殘留量的檢測。

[1]孟昭赫.食品衛(wèi)生檢驗方法注釋（微生物學(xué)部分）[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1996:38-43.

[2]何家香.原料乳中抗生素殘留的現(xiàn)狀與對策[J].當(dāng)代禽畜養(yǎng)殖業(yè),2003(8):53-54.

[3]李銀生,曾振玲.獸藥殘留的現(xiàn)狀與危害[J].中國獸藥,2002,12(1):21-23.

[4]Kukurová I,Hozová B.Interactions of antimicrobials in milk and their detection by the disk diffusion method and Delvotest SP[J].Journal of AOAC international,2003,86(3):529-533.

[5]Jones G M.On-farm test for drug residues in milk[J].Virgina Tech,1995,26(5):401-404.

[6]Seymour E H,Jones G M,McGilliard M L.Persistence of residues in milk following antibiotic treatment[J].Journal of Dairy Science,1988,71(8):2292-2296.

[7]Budaest H.Criteria for evaluating acceptable methods for codex purposes[S].Joint FAO/WHO Food Standards Programme,Codex Committee on Methods of Analysis and Sampling:19th Session,1994.

[8]馬兆瑞,祝戰(zhàn)斌,卡爾·萊金特.乳和乳制品中殘留抗生素的檢測方法[J].中國乳品工業(yè),2003,31(4):37-40.