(河南省食品藥品檢驗(yàn)所，河南 鄭州 450003)

注射用氨磷汀是一種有機(jī)硫化磷酸化合物，在組織中被與細(xì)胞膜結(jié)合的堿性磷酸酶水解脫磷酸后成為具有活性的代謝產(chǎn)物WR－1065，所含巰基具有清除組織中自由基的作用，能降低順鉑、環(huán)磷酰胺、絲裂霉素等藥物的毒性[1]，故筆者根據(jù)藥物分類(lèi)及注射劑研制要求，結(jié)合注射劑安全性試驗(yàn)指導(dǎo)原則，對(duì)注射用氨磷汀做了安全性試驗(yàn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

1.1 藥物和試劑

注射用氨磷汀(批號(hào)為20090301，規(guī)格為0.4 g/瓶，河南省大明制藥有限公司);氯化鈉注射液(批號(hào)為090212211，鄭州永和制藥有限公司);牛血清白蛋白(批號(hào)為32093239，北京索萊寶科技有限公司);依文思藍(lán)(批號(hào)為87－04－01，上海化學(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站分裝廠進(jìn)口分裝);甲醛(天津市化學(xué)試劑三廠)。

1.2 動(dòng)物

豚鼠，普通級(jí)，體重300～400 g(雌雄不拘)，購(gòu)自北京沙河通利試驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)，許可證號(hào)為SCXK(京)2005－0003;SD大鼠，清潔級(jí)，體重180～220 g(雌雄各半)，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SCXK(豫)2005－0001;日本大耳白家兔，普通級(jí)，體重2.0～3.0 kg(雌雄不拘)，購(gòu)自河南省康達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)為SCXK(豫)2005－0002。雌雄動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，自由飲水。環(huán)境溫度(23±2)℃，相對(duì)濕度50% ～65%，12 h光照明暗交替，通風(fēng)良好。

1.3 儀器

CP225D型電子天平(德國(guó)Sartorius公司);PB4002－S型電子天平(瑞士Mettler Toledo儀器有限公司);SF2000型三按鍵電子數(shù)顯卡尺(桂林廣陸數(shù)字測(cè)控股份有限公司);RTZ－10A－RT型嬰兒秤(無(wú)錫市衡器廠);DR－HW－1型電熱恒溫水溫箱(北京西城區(qū)醫(yī)療器械廠);CH30型顯微鏡(日本Olympus公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 全身主動(dòng)過(guò)敏性試驗(yàn)(ASA)

取健康豚鼠24只，隨機(jī)分為4組(每組6只):陰性對(duì)照組給予0.9%氯化鈉注射液;陽(yáng)性對(duì)照組給予0.5%牛血清白蛋白;注射用氨磷汀高劑量組給予注射用氨磷汀，致敏劑量為163 mg/kg，激發(fā)劑量為326 mg/kg;注射用氨磷汀低劑量組給予注射用氨磷汀，致敏劑量為81 mg/kg，激發(fā)劑量為163 mg/kg;給藥質(zhì)量濃度均為57 g/L。隔日每只每次腹腔注射注射用氨磷汀0.5 mL(高劑量組致敏容積為1.0 mL)，共3次，進(jìn)行致敏，然后各組再分為2組，每組3只，分別在首次注射后第14日和第21日由耳緣靜脈注射注射用氨磷汀1.0 mL進(jìn)行攻擊(高劑量組激發(fā)容積為2.0 mL)。每日觀察動(dòng)物的癥狀，靜脈注射后30 min內(nèi)觀察每只動(dòng)物的癥狀反應(yīng)，根據(jù)過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生率和發(fā)生程度進(jìn)行綜合判斷[2－4]。結(jié)果陽(yáng)性對(duì)照組6只豚鼠均出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)，為極強(qiáng)陽(yáng)性(++++);陰性對(duì)照組和注射用氨磷汀高、低劑量組豚鼠均未出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)。

2.2 被動(dòng)皮膚過(guò)敏性試驗(yàn)(PCA)

抗體制備:取大鼠8只，隨機(jī)分為4組(每組2只):陰性對(duì)照組給予0.9%氯化鈉注射液;陽(yáng)性對(duì)照組給予1%牛血清白蛋白;注射用氨磷汀高劑量組給予注射用氨磷汀，給藥質(zhì)量濃度為20 g/L，致敏劑量為200 mg/kg;注射用氨磷汀低劑量組給予注射用氨磷汀，給藥質(zhì)量濃度為10 g/L，致敏劑量為100 mg/kg(均以0.9%氯化鈉注射液復(fù)溶)。隔日每只每次腹腔注射注射用氨磷汀每100 g體重1.0 mL/100 g，共3次，進(jìn)行致敏。末次致敏后10 d采血，以2 000 r/min轉(zhuǎn)速離心處理10 min，分離血清，合并每組大鼠血清，分別制得混合抗血清，－20℃保存，2周內(nèi)備用。

試驗(yàn)方法:取大鼠24只，隨機(jī)分為4組(每組6只)，分組及給藥方法同抗體制備項(xiàng)下方法。試驗(yàn)前，動(dòng)物背部脫毛3 cm×4 cm，然后皮內(nèi)注射各對(duì)應(yīng)組的抗血清0.1 mL(抗血清的稀釋度為1∶2)，進(jìn)行被動(dòng)致敏。48 h后分別在各組尾靜脈注射含1%依文思藍(lán)的對(duì)應(yīng)供試品，給藥容積均為每100 g體重0.5 mL。30 min后脫臼處死各組動(dòng)物，剪取背部皮膚，測(cè)量皮膚內(nèi)層藍(lán)色反應(yīng)斑的直徑，并進(jìn)行比較。

結(jié)果:陽(yáng)性對(duì)照組大鼠藍(lán)斑直徑大于5 mm，為(6.63±1.66)mm，呈陽(yáng)性;高劑量組為(1.06±1.66)mm，陰性對(duì)照組和注射用氨磷汀低劑量組大鼠藍(lán)斑直徑小于5 mm，呈陰性。

2.3 體外溶血試驗(yàn)

2%紅細(xì)胞懸液配制:取健康家兔1只，自心臟取血10 mL左右，放入含玻璃珠的干燥三角燒瓶中，振搖10 min，除去纖維蛋白原，使成脫纖血液。將去纖維蛋白血移入刻度離心管內(nèi)，加5%葡萄糖注射液約10倍量，搖勻，以1 500 r/min轉(zhuǎn)速離心處理15 min，傾去上清液，沉淀的紅細(xì)胞再用5%葡萄糖注射液按上述方法洗滌2～3次，至上清液不顯紅色為止。將所得紅細(xì)胞按其容積用5%葡萄糖注射液配成2%的混懸液。

試驗(yàn)方法:取潔凈試管7支，編號(hào)，1號(hào)至5號(hào)管為供試品管，6號(hào)管為陰性對(duì)照管，7號(hào)管為陽(yáng)性對(duì)照管。按表1依次加2%紅細(xì)胞懸液、5%葡萄糖注射液、純化水、受試藥物，混勻后立即置(37±0.5)℃的水浴鍋內(nèi)溫育。開(kāi)始每隔15 min觀察1次，1 h后，每隔1 h觀察1次，最長(zhǎng)觀察3 h。

結(jié)果:陽(yáng)性對(duì)照管有溶血發(fā)生，溶液呈澄明紅色，管底幾無(wú)紅細(xì)胞殘留;陰性對(duì)照管和注射用氨磷汀各管均無(wú)溶血和凝聚發(fā)生，紅細(xì)胞全部下沉，上清液無(wú)色澄明。顯微鏡下觀察，陰性對(duì)照管和注射用氨磷汀各管紅細(xì)胞形態(tài)正常。

表1 體外溶血試驗(yàn)加藥方法

2.4 血管刺激性試驗(yàn)

取健康家兔4只，采用同體左右側(cè)自身對(duì)比法，于左側(cè)耳緣靜脈注射0.9%氯化鈉注射液，右側(cè)耳緣靜脈緩緩注射氨磷汀40 mg/kg，給藥質(zhì)量濃度為20 g/L，給藥容積均為2.0 mL/kg，1天1次，連續(xù)5 d。每天給藥前及末次給藥后48，72，96 h對(duì)動(dòng)物和注射部位進(jìn)行肉眼觀察，觀察期結(jié)束時(shí)，取2只動(dòng)物的耳緣靜脈近心端血管2～3 cm供病理組織學(xué)檢查，留下的2只動(dòng)物繼續(xù)觀察14 d再進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，以了解刺激性反應(yīng)的可逆程度。在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)觀察，結(jié)果家兔雙側(cè)耳未見(jiàn)明顯充血水腫，血管均正常。病理組織學(xué)檢查顯示，給藥結(jié)束時(shí)左耳鱗狀上皮無(wú)增生、萎縮、上皮下無(wú)充血、水腫及炎癥?；謴?fù)14 d后各動(dòng)物左右耳均未見(jiàn)血管擴(kuò)張和炎細(xì)胞浸潤(rùn)，提示本品對(duì)家兔血管無(wú)刺激性。

3 討論

注射藥物的安全性評(píng)價(jià)是藥物臨床前試驗(yàn)研究的一個(gè)重要組成部分，主要由過(guò)敏性試驗(yàn)、體外溶血試驗(yàn)、血管刺激性試驗(yàn)等組成，其試驗(yàn)方法和評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)可參照2005年國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局《化學(xué)藥物刺激性、過(guò)敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》。

本試驗(yàn)受試藥物劑量依據(jù)注射用氨磷汀使用說(shuō)明書(shū)，用于化學(xué)治療患者最大劑量，按體表面積一次600 mg/m2，溶于0.9%氯化鈉注射液50 mL中靜脈滴注。計(jì)算的人用劑量為16.2 mg/kg(按60 kg體重計(jì))，折算成動(dòng)物等效劑量。在預(yù)試驗(yàn)給予此劑量未發(fā)生毒性反應(yīng)的原則下，將此劑量設(shè)為受試物低劑量的致敏劑量，受試物高劑量則給予低劑量的數(shù)倍量，本試驗(yàn)設(shè)定的高劑量為低劑量的2倍量，激發(fā)劑量一般為致敏劑量的2～5倍。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，注射用氨磷汀對(duì)紅細(xì)胞未見(jiàn)溶血和凝聚作用，全身主動(dòng)過(guò)敏試驗(yàn)及被動(dòng)皮膚過(guò)敏性試驗(yàn)均未見(jiàn)過(guò)敏反應(yīng)，家兔靜脈注射給藥后未見(jiàn)血管刺激性，說(shuō)明本品安全性良好，可靜脈注射給藥。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(二部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:附錄ⅪK.

[2]陳 奇.中藥藥理研究方法學(xué)[M].第2版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2006:157.

[3]徐叔云，卞如廉，陳 修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].第3版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2002:237.

[4]袁伯俊，王治喬.新藥臨床前安全性評(píng)價(jià)與實(shí)踐[M].北京:軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社，1997:46.