付 曉 朱夢瑜 高星杰 錢寶鑫 王保亞 趙 虹 葛 林 楊 潔

人類Tudor-SN（tudor staphylococcal nuclease）蛋白，又稱為p100蛋白、SND1（staphylococcal nuclease domain containing 1），首次作為EB病毒細胞核抗原2（Epstein-Barr virus nuclear protein 2，EBNA2）的轉(zhuǎn)錄調(diào)控激活因子被發(fā)現(xiàn)[1]。Callebaut等[2]運用疏水簇結(jié)構(gòu)分析（hydrophobic cluster analysis，HCA）發(fā)現(xiàn)人類Tudor-SN蛋白由N端4個重復葡萄球菌核酸酶樣（staphylococcal nucleases-like，SN-like）的SN（1～4）結(jié)構(gòu)域及C端的Tudor-SN 5（TSN）結(jié)構(gòu)域組成。本研究采用能夠表達紅色熒光蛋白（red fluorescent protein，RFP）的pERFP-C1質(zhì)粒載體，構(gòu)建pER?FP-C1-hTudor-SN-SN(1～4)重組質(zhì)粒，在真核細胞內(nèi)表達帶紅色熒光標簽的Tudor-SN蛋白SN（1～4）各功能片段，從而為深入研究Tudor-SN蛋白SN結(jié)構(gòu)域的生物學功能提供便利工具。

1 材料與方法

1.1 材料 真核表達質(zhì)粒pSG5-Tudor-SN-flag、pERFP-C1-Tudor-SN，大腸桿菌DH5α及HeLa細胞均為本實驗室保存。限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ及T4 DNA連接酶均購自Fer?mentas公司，Taq酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，T/A載體（pTZ57R/T）購自大連Takara生物工程公司，B型小量DNA快速回收試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司，質(zhì)粒快速小提試劑盒購自北京索來寶科技有限公司，去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購自Omega公司，Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司。倒置熒光顯微鏡購自日本Olym?pus公司，顯微數(shù)碼攝影機購自日本Nikon公司，引物由北京六合通公司合成，基因測序工作由北京天一輝遠生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 目的片段的獲取 參照質(zhì)?？焖傩√嵩噭┖袃?nèi)說明書提取pSG5-Tudor-SN-flag質(zhì)粒DNA。根據(jù)Tudor-SN的SN（1～4）結(jié)構(gòu)域序列設計含有EcoRⅠ和BamHⅠ限制性內(nèi)切酶位點的引物序列，見表1。以pSG5-Tudor-SN-flag質(zhì)粒DNA為模板，PCR擴增SN（1～4）各片段，條件為95℃預變性5 min,95℃30 s,55℃45 s,72℃3 min共33個循環(huán)，72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，紫外燈下切割含有目的條帶的凝膠塊，利用凝膠回收試劑盒進行目的片段回收，在T4 DNA連接酶作用下，與T/A載體22℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌DH5α，在含有氨芐的LB平板上篩選克隆。挑取陽性克隆，搖菌擴增并提取質(zhì)粒。以EcoRⅠ和BamHⅠ進行雙酶切，凝膠回收試劑盒回收并純化各目的片段。

表1 Tudor-SN的SN(1～4)功能片段引物序列

1.2.2 線性pERFP-C1的獲取 采用pERFP-C1質(zhì)粒載體，見圖1。以質(zhì)?？焖傩√嵩噭┖刑崛ERFP-C1-Tudor-SN質(zhì)粒DNA，采用EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切pERFP-C1-Tudor-SN質(zhì)粒，完整切下線性pERFP-C1質(zhì)粒載體，瓊脂糖電泳。凝膠回收試劑盒回收得到約4 700 bp線性pERFP-C1。

1.2.3 重組真核表達質(zhì)粒pERFP-C1-Tudor-SN-SN（1～4）的構(gòu)建 在T4 DNA連接酶作用下，將線性pERFP-C1質(zhì)粒載體與具有相同黏性末端的Tudor-SN各功能片段SN(1～4)進行22℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌大腸桿菌DH5α，在含有卡那霉素的LB平板上篩選克隆。挑取陽性克隆，搖菌擴增并提取重組質(zhì)粒。

圖1 pERFP-C1質(zhì)粒圖譜

1.2.4 單、雙酶切及基因測序鑒定 用EcoRⅠ和BamHⅠ對重組質(zhì)粒pERFP-C1-Tudor-SN-SN（1～4）進行單、雙酶切，并以1.5%的瓊脂糖凝膠電泳驗證片段的大小。同時，對重組質(zhì)粒進行基因測序鑒定。

1.2.5 HeLa細胞的轉(zhuǎn)染及熒光顯微鏡觀察 以去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取無內(nèi)毒素重組質(zhì)粒。HeLa細胞接種至10 mm培養(yǎng)皿中，置于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細胞80%匯合時，依據(jù)產(chǎn)品說明書進行脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48 h，在倒置熒光顯微鏡下觀察pERFP-C1-Tudor-SN-SN（1～4）的表達并以顯微數(shù)碼攝影機拍照。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增目的片段 以pSG5-Tudor-SN-flag為模板進行PCR擴增，再以1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，結(jié)果在500 bp左右觀察到與目的片段長度相符的熒光條帶，見圖2。

圖2 目的片段SN（1～4）的獲取

2.2 線性pERFP-C1質(zhì)粒載體的獲取 采用EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切pERFP-C1-Tudor-SN質(zhì)粒，切下完整的線性pERFP-C1質(zhì)粒載體，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，在4 700 bp左右出現(xiàn)條帶，見圖3，純化回收后用于后續(xù)的連接反應。

圖3 線性pERFP-C1質(zhì)粒載體的獲取

2.3 重組真核表達質(zhì)粒pERFP-C1-Tudor-SN-SN（1～4）的鑒定

2.3.1 單、雙酶切及測序鑒定 將構(gòu)建的重組質(zhì)粒分別進行EcoRⅠ和BamHⅠ的單、雙酶切，產(chǎn)生的條帶大小與預期相符，見圖4，重組質(zhì)?；驕y序結(jié)果正確，證明Tudor-SN-SN（1～4）各功能片段已成功插入到pERFP-C1的多克隆位點上。

圖4 pERFP-C1-Tudor-SN-SN（1～4）的單、雙酶切鑒定圖

2.3.2 熒光顯微鏡下觀察重組質(zhì)粒的表達 在10 mm培養(yǎng)皿上接種HeLa細胞，脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染pER?FP-C1-Tudor-SN-SN（1～4），培養(yǎng)48 h后，熒光顯微鏡下可見紅色熒光蛋白RFP-Tudor-SN-SN（1～4）的表達，見圖5。

3 討論

本研究所采用的pERFP-C1是將pEGFP-C1載體中編碼綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的基因替換為櫻桃紅色熒光蛋白（cher?ry-RFP）基因后得到的一種真核質(zhì)粒載體，其多克隆位點（multiple cloning site,MCS）位于RFP序列和SV40 polyA之間。插入到MCS的目的基因如果與RFP基因的閱讀框一致，就可以與RFP的C末端融合表達，且目的蛋白的生物學活性通常不受影響。重組真核紅色熒光質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入細胞后并不干擾細胞的生長，還可根據(jù)紅色熒光信號來定位示蹤目的蛋白，故該質(zhì)?？捎糜诨罴毎麪顟B(tài)下目的基因表達的觀察、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率的鑒定及蛋白間結(jié)合關系的研究等。

圖5 熒光顯微鏡下觀察重組質(zhì)粒的表達（×40）

真核基因表達是一個精細復雜的過程，包括基因轉(zhuǎn)錄、pre-mRNA剪接、mRNA翻譯等步驟?；蜣D(zhuǎn)錄和pre-mRNA剪接并非2個獨立的的過程，常通過某些特定蛋白的作用而緊密相聯(lián)[3]。人類Tu?dor-SN蛋白就是一種可偶聯(lián)調(diào)控轉(zhuǎn)錄和剪接過程的多功能蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，Tudor-SN蛋白作為一種轉(zhuǎn)錄共激活因子，借助其N端重復的SN結(jié)構(gòu)域與c-Myb[4],STAT6[5],STAT5[6]等多種啟動子特異轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，在基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用。本研究將Tudor-SN蛋白的SN（1～4）基因序列成功插入到pERFP-C1質(zhì)粒中，構(gòu)建針對SN結(jié)構(gòu)域的紅色熒光重組質(zhì)粒，其可與特定轉(zhuǎn)錄因子的綠色熒光重組質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染入真核細胞，通過共聚焦顯微鏡技術(shù)進行共定位分析，將有助于進一步研究Tudor-SN蛋白不同SN片段在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用。

葡萄球菌核酸酶又稱為耐熱核酸酶，是一種Ca2+依賴酶，可水解單/雙鏈DNA和RNA的5-磷酸二酯鍵，生成3-單核苷酸和多核苷酸，其催化能力主要依賴于其氨基酸序列中的2個活化位點[7]。人類Tudor-SN蛋白的SN結(jié)構(gòu)域雖與葡萄球菌核酸酶相似，卻未發(fā)現(xiàn)此活化位點，推測其可能沒有催化DNA的能力[8]。然而，Tudor-SN蛋白SN結(jié)構(gòu)中的第一個亞結(jié)構(gòu)域（98個氨基酸）卻含有可識別多種核苷酸的保守OB折疊結(jié)構(gòu)（oligonucleotide/oligosac?charide-binding fold，寡聚核苷/寡聚糖結(jié)合折疊）[2]，提示Tudor-SN蛋白的SN結(jié)構(gòu)域雖沒有核酸酶的催化位點，但仍有可能與核酸結(jié)合。本研究成功進行了Tudor-SN蛋白不同SN結(jié)構(gòu)域的紅色熒光標記，有助于深入探討該多功能蛋白在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、核酸代謝及相關疾病發(fā)生中的作用。

[1]TongX,Drapkin R,Yalamanchili R,et al.The Epstein-Barr virus nuclear protein 2 acidic domain forms a complex with a novel cellu?lar coactivator that can interact with TFIIE[J].Mol Cell Biol,1995, 15(9):4735-4744.

[2]Callebaut I，Mornon JP.The human EBNA-2 coactivator p100:mul?tidomaian organization and relationship to the staphylococcal nucle?ase fold and to the tudor protein involved in Drosophila melanogas?ter development[J].Biochem J,1997,321(Pt1):125-132.

[3]Kornblihtt AR,de la Mata M,Fededa JP,et al.Multiple links be?tween transcription and splicing[J].RNA,2004,10(10):1489-1498. [4]Leverson JD,Koskinen PJ,Orrico FC,et al.Pim-1 kinase and p100 cooperate to enhance c-Myb activity[J].Mol Cell,1998,2(4): 417-425.

[5]Yang J,Aittomaki S,Pesu M,et al.Identification of p100 as a coacti?vator for STAT6 that bridges STAT6 with RNA polymeraseⅡ[J].EM?BO J,2002,21(18):4950-4958.

[6]Paukku K,Yang J,Silvennoinen O.Tudor and nuclease-like do?mains containing protein p100 function as coactivators for signal transducer and activator of transcription 5[J].Mol Endocrinol,2003, 17(9):1805-1814.

[7]HynesTR,Fox RO.The crystal structure of Staphylococcal nuclease refined at 1.7 A resolution[J].Proteins Struct Funct Genet,1991,10 (2):92-105.

[8]Ponting CP.P100,a transcriptional coactivator,is a human homo?logue of staphylococcal nuclease[J].Protein Sci,1997,6(2): 459-463.