近紅外熒光（near infrared fluorescent，NIRF）顯像是熒光探針在特定波長(zhǎng)紅光激發(fā)下，發(fā)出NIRF（700～900nm），通過顯像系統(tǒng)再現(xiàn)出組織內(nèi)部熒光分布的顯像技術(shù)，是近年來的分子影像研究熱點(diǎn)之一[1]。該顯像具有高時(shí)間敏感性、實(shí)時(shí)性、無輻射性及長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)可能性等諸多優(yōu)勢(shì)，成為體內(nèi)顯像的焦點(diǎn)。迄今為止，已有美國(guó)、日本及德國(guó)的幾個(gè)臨床研究小組報(bào)道了NIRF顯像臨床研究，其中以淋巴水腫（lymphedema）的診斷及前哨淋巴結(jié)活檢較為多見[2～5]。

NIRF淋巴顯像最先由Unno等[6]于2007年提出，他們對(duì)10例健康人及12例下肢繼發(fā)性淋巴水腫患者進(jìn)行NIRF顯像，初步顯示了NIRF淋巴顯像的優(yōu)勢(shì)。隨后，Sevick-Muraca研究小組亦應(yīng)用NIRF顯像進(jìn)行了健康人NIRF淋巴顯像，成功論證了該顯像方法的可行性及優(yōu)越性[3,7,8]。

本研究旨在進(jìn)一步探索正常肢體與淋巴水腫肢體在淋巴結(jié)構(gòu)及功能上的異同，研究不同程度肢體淋巴水腫患者的顯像特點(diǎn)及與疾病病程的關(guān)系，制訂診斷標(biāo)準(zhǔn)，以論證NIRF淋巴顯像的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究對(duì)20例正常人及20例診斷為單側(cè)肢體淋巴性水腫患者（上肢水腫10例，下肢水腫10例）進(jìn)行NIRF淋巴顯像，其中男性6例，女性34例；年齡29～67歲，平均年齡44歲。在淋巴水腫患者中，原發(fā)性水腫3例，繼發(fā)性水腫17例（術(shù)后13例，外傷后2例，感染性疾病引起2例）。

1.2 儀器設(shè)備 所用設(shè)備為自行研制的 NIRF學(xué)顯像儀：激光二極管500mW，激發(fā)光785nm/1.9mW/cm2/ 900cm2；785nm全息陷波濾波器（光學(xué)強(qiáng)度≥6），830nm通帶濾光片（光學(xué)強(qiáng)度≥4）；CCD（charge coupled device）相機(jī)（28nm 尼康Nikkor鏡片）；第三代影像增強(qiáng)器。

1.3 顯像劑 本研究采用吲哚青綠（indocyanine green，ICG，Akron Inc.）作為NIRF顯像劑。制備方式為：將 ICG凍干粉用生理鹽水稀釋為 0.25mg/m l的注射液，每支注射器抽取100μl ICG注射液待用。

1.4 注射方法及采集條件 受檢者仰臥于受檢床上，暴露受檢部位。以上肢為受檢部位者，將在雙手第2、4指璞間，腕部掌面2處，前臂內(nèi)外兩側(cè)等6處皮內(nèi)注射ICG；而以下肢為觀察對(duì)象者，將在雙足第2、4趾璞間，內(nèi)踝，小腿內(nèi)側(cè)外，大腿內(nèi)側(cè)等6處皮內(nèi)注射 ICG。每注射點(diǎn) ICG注射劑量為25μg/100μl，總注射量＜0.4mg/人次，黑色膠布遮蓋注射點(diǎn)。注射后15min，患者佩戴激光防護(hù)眼鏡，行雙側(cè)肢體的動(dòng)態(tài)采集，采集順序通常由肢體遠(yuǎn)端至肢體近端，采集速度為200ms/幀。

1.5 圖像分析 所得20例正常人及20例淋巴水腫患者四肢NIRF圖像均應(yīng)用Image J（NIH）及Matlab（Mathworks）軟件進(jìn)行處理及回顧性分析。其中，淋巴管結(jié)構(gòu)、NIRF分布區(qū)域、淋巴回流狀態(tài)、淋巴推進(jìn)間隔時(shí)間及區(qū)域淋巴結(jié)為觀測(cè)要點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 正常淋巴顯影 正常人皮內(nèi)注射 ICG后 15～30m in肢體淋巴管開始顯影，45m in后顯影清晰。正常肢體淋巴回流具有如下特點(diǎn)：①肢體淋巴鏈顯影清晰，淋巴管呈規(guī)則的樹枝狀分布（圖 1）；②淋巴液從肢體遠(yuǎn)端向近端單向向心性、“彈丸”式回流（圖2）；③組織間隙顯影清晰，未見淋巴管外顯像劑分布；④區(qū)域淋巴結(jié)形態(tài)清楚（圖1E、1F）。定量測(cè)量雙側(cè)肢體淋巴回流，結(jié)果顯示雙側(cè)肢體淋巴回流速度及淋巴推進(jìn)間隔相似，淋巴回流平均速度為0.7～0.8cm/s；淋巴推進(jìn)間隔平均為37～40s。

2.2 淋巴水腫 根據(jù)肢體淋巴管結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、NIRF分布區(qū)域、淋巴回流狀態(tài)、淋巴推進(jìn)間隔時(shí)間及區(qū)域淋巴結(jié)是否顯影等要點(diǎn)，NIRF淋巴顯像將淋巴水腫分為4級(jí)。

Ⅰ級(jí)淋巴水腫的NIRF淋巴顯像表現(xiàn)為（圖3）：①小片狀淋巴管外顯像劑影；②主要淋巴管顯示清晰，可見多條極度彎曲側(cè)支淋巴管；③淋巴回流仍為“彈丸”式向心流動(dòng)，回流速度較對(duì)側(cè)正常肢體略減慢；④可出現(xiàn)“淋巴反流”；⑤區(qū)域淋巴結(jié)可顯影。

圖1 上肢正常淋巴引流。A～D分別顯示了手背、前臂背面、前臂掌面及上臂側(cè)面的淋巴回流的結(jié)構(gòu)，可見淋巴管呈規(guī)則的樹枝狀分布，淋巴管外未見顯像劑滯留。E、F分別顯示肘部及腋窩淋巴結(jié)（箭頭所示）（黑色避光膠布覆蓋注射點(diǎn)）

Ⅱ級(jí)淋巴水腫圖像（圖4）：①組織間隙特征性出現(xiàn)絮狀、云霧狀的大片NIRF顯像劑滯留現(xiàn)象；②可見毛細(xì)淋巴管網(wǎng)影及多條細(xì)小彎曲側(cè)支淋巴管；③云絮狀影間可見主淋巴管相互交通，但其回流速度減慢，推進(jìn)間隔延長(zhǎng)；④多可見“淋巴反流”，注射點(diǎn)遠(yuǎn)端（手掌及腳掌）出現(xiàn)NIRF顯像劑；⑤淋巴結(jié)可或無顯影。

Ⅲ級(jí)淋巴水腫圖像（圖5）：①樹枝狀淋巴管狀結(jié)構(gòu)消失，絮狀、云霧狀影遍及全部肢體。表明大量 NIFR顯像劑滯留在組織間隙；②可見毛細(xì)淋巴管網(wǎng)及多條細(xì)小彎曲側(cè)支淋巴管；③部分側(cè)支淋巴管偶見“彈丸”式流動(dòng)；④“淋巴反流”現(xiàn)象普遍存在，注射點(diǎn)遠(yuǎn)端可見大片狀 NIRF顯像劑；⑤無區(qū)域淋巴結(jié)顯影。

Ⅳ級(jí)淋巴水腫圖像：NIRF顯像劑滯留于注射部位，患肢無淋巴管狀結(jié)構(gòu)及淋巴引流，區(qū)域淋巴結(jié)不顯影；少部分患者NIRF顯像劑可從注射點(diǎn)處逆流到皮膚表面。

圖2 正常前臂背面可見規(guī)則的淋巴管結(jié)構(gòu)（箭頭所示），淋巴回流呈“彈丸”式（紅色圓圈所示）向心性流動(dòng)圖3 下肢Ⅰ級(jí)淋巴水腫。A.小腿內(nèi)側(cè)NIRF顯像圖，小腿近膝部可見小片狀淋巴管外顯像劑滯留（短箭頭所示），周圍可見細(xì)小彎曲側(cè)支淋巴管（長(zhǎng)箭頭所示），與主淋巴管相連；B.注射點(diǎn)周圍多條極度彎曲側(cè)支淋巴管（長(zhǎng)箭頭所示）；C.小腿內(nèi)側(cè)可見規(guī)則樹枝狀淋巴管結(jié)構(gòu)，內(nèi)可見“彈丸”式淋巴液流動(dòng)（圓圈所示）；D.大腿內(nèi)側(cè)可見規(guī)則淋巴管，腹股溝可見淋巴結(jié)影（長(zhǎng)箭頭所示）（黑色避光膠布覆蓋注射點(diǎn)）

圖4 下肢Ⅱ級(jí)淋巴水腫。A.足部背部可見規(guī)則淋巴管結(jié)構(gòu)（長(zhǎng)箭頭所示）；B.膝部特征性出現(xiàn)絮狀、云霧狀的大片NIRF顯像劑滯留（短箭頭所示）；C.小腿多處大片狀云絮影（短箭頭所示），其間見正常淋巴管相互交通（長(zhǎng)箭頭所示）；D.小腿背面可見絮狀、云霧狀的大片NIRF顯像劑滯留，毛細(xì)淋巴管網(wǎng)影及多條細(xì)小彎曲側(cè)支淋巴管隱約可見 圖5Ⅲ級(jí)淋巴水腫表現(xiàn)。A、B.為前臂及小腿NIRF淋巴顯像，圖像顯示規(guī)則淋巴管影消失，全部肢體可見絮狀、云霧狀淋巴管外顯像劑影，其內(nèi)可見毛細(xì)淋巴管網(wǎng)影。C、D.顯示手掌及足底的“淋巴反流”現(xiàn)象，即注射點(diǎn)的遠(yuǎn)端（手掌及腳掌）出現(xiàn)顯影劑

3 討論

淋巴水腫是淋巴液回流障礙引起的組織間隙淋巴液異常增多的慢性進(jìn)展性疾病。臨床上通過病史、癥狀和體征，并采用排除法做出診斷。但對(duì)于疾病的嚴(yán)重程度、不典型病例的判斷、療效的評(píng)估，影像學(xué)仍是主要的診斷手段[9]。常用的影像學(xué)方法有X線淋巴造影、核素淋巴顯像及磁共振成像等，靜態(tài)反映了淋巴管的結(jié)構(gòu)及功能。若需動(dòng)態(tài)地、定量地觀測(cè)淋巴回流狀態(tài)，進(jìn)行療效實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，就需要一種新的影像手段——NIRF淋巴顯像[1]。

NIRF淋巴顯像是一種新的淋巴顯像方法，具有不可比擬的顯像優(yōu)勢(shì)：①具有極高的時(shí)間分辨率。NIRF染料能每秒發(fā)送1億光子（放射性核素每秒發(fā)射1個(gè)光子），使實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)顯示淋巴系統(tǒng)結(jié)構(gòu)及功能成為可能；②能定量測(cè)量淋巴回流速度及淋巴推進(jìn)間隔，有利于對(duì)比研究各種治療方法及判定療效；③NIRF染料可重復(fù)激發(fā)，行多次NIRF顯像，有利于隨診監(jiān)控疾病的進(jìn)程及評(píng)估遠(yuǎn)期治療療效；④NIRF染料沒有放射性，操作人員無放射性輻射；⑤顯像設(shè)備簡(jiǎn)單，體積較小，價(jià)格低廉，有利于臨床推廣[7]。

本研究應(yīng)用NIRF淋巴顯像，首先分析了20例正常肢體淋巴系統(tǒng)的特點(diǎn)。結(jié)果顯示，正常肢體通常具有規(guī)則淋巴管狀結(jié)構(gòu)，淋巴回流始終為向心性、“彈丸”式流動(dòng)，淋巴管外并沒有顯像劑的滯留及毛細(xì)淋巴網(wǎng)影出現(xiàn)，區(qū)域淋巴結(jié)通?？汕逦@影。隨后，我們對(duì)20例肢體淋巴水腫的患者進(jìn)行了NIRF淋巴顯像。在對(duì)比疾病病程的病理生理學(xué)表現(xiàn)與淋巴水腫患者的圖像后，我們發(fā)現(xiàn)不同級(jí)別淋巴水腫的影像學(xué)表現(xiàn)與疾病病程呈正相關(guān)。

在淋巴水腫早期，淋巴管道輕度阻塞，富含蛋白的淋巴在組織間隙輕度聚集，此時(shí)無組織纖維化或輕微纖維化，因此，NIRF圖像上僅表現(xiàn)為少量顯像劑滯留于淋巴管外。由于淋巴管道阻塞，機(jī)體將在淋巴管主干周圍代償產(chǎn)生發(fā)育不良的側(cè)支淋巴管，這種新生小淋巴管較正常淋巴管不同，通常表現(xiàn)為細(xì)小并極度扭曲的管狀結(jié)構(gòu)。同時(shí)，淋巴管道的輕度阻塞將導(dǎo)致回流的淋巴液量減少，淋巴回流速度減慢，淋巴推進(jìn)間隔輕度延長(zhǎng)。區(qū)域淋巴結(jié)因能接收到淋巴回流從而顯影。以上為Ⅰ級(jí)淋巴水腫的影像表現(xiàn)。

隨著病程的延續(xù)，肢體多個(gè)部位的水腫和纖維化加重，不同程度地累及殘留的正常淋巴管及淋巴管內(nèi)瓣膜，使淋巴管壁的通透性下降，內(nèi)部收縮力減弱，瓣膜功能不全，淋巴不能有效地引流到淋巴管中，甚至出現(xiàn)“淋巴反流”，因此病變部位處的組織間隙滯留了大量的淋巴液。隨后，側(cè)支循環(huán)增多，形成大片毛細(xì)淋巴管網(wǎng)影，淋巴主干內(nèi)的淋巴回流減少、減慢。因此，Ⅱ級(jí)淋巴水腫NIRF圖像上可見肢體多部位出現(xiàn)大片絮狀、云霧狀造影劑聚集在組織間隙中，顯影劑周圍可見細(xì)小彎曲的側(cè)支淋巴管及毛細(xì)淋巴管網(wǎng)影。殘存的淋巴管主干連接毛細(xì)淋巴管網(wǎng)，其內(nèi)淋巴回流速度減慢，淋巴推進(jìn)間隔明顯延長(zhǎng)。由于“淋巴反流”，注射點(diǎn)遠(yuǎn)端，如手掌或腳掌，出現(xiàn)NIRF顯像劑。

皮下組織纖維化易引發(fā)并發(fā)癥——淋巴管炎和蜂窩織炎，進(jìn)一步加劇皮下組織纖維化的速度，淋巴管完全阻塞，大量淋巴液滯留于組織間隙中。因此，Ⅲ級(jí)淋巴水腫時(shí)，肢體的正常淋巴管狀結(jié)構(gòu)消失，取而代之的是遍及肢體的毛細(xì)淋巴管網(wǎng)影及皮下大量絮狀、云霧狀顯像劑滯留?！傲馨头戳鳌爆F(xiàn)象顯著，注射點(diǎn)的遠(yuǎn)端（手掌及腳掌）可見顯像劑。引流區(qū)域內(nèi)將無淋巴結(jié)顯影。

Ⅳ級(jí)淋巴水腫時(shí)，皮膚組織極度纖維化，常伴有嚴(yán)重表皮角化及棘狀物生成，形成象皮腫。此時(shí)，造影劑僅停留在注射點(diǎn)處，甚至連同淋巴液順著注射點(diǎn)反流到皮膚表面。

綜上所述，NIRF淋巴顯像診斷淋巴水腫的診斷要點(diǎn)如下：①淋巴管外是否有NIRF顯像劑的滯留；②是否出現(xiàn)極度彎曲的側(cè)支淋巴管及毛細(xì)淋巴管網(wǎng)；③樹枝狀淋巴管結(jié)構(gòu)是否存在；④淋巴回流速度是否減慢，推進(jìn)間隔時(shí)間是否延長(zhǎng)；⑤是否出現(xiàn)“淋巴反流”現(xiàn)象，注射遠(yuǎn)端是否出現(xiàn)造影劑；⑥區(qū)域淋巴結(jié)是否顯影。其中，以要點(diǎn)①作為區(qū)分水腫與非水腫的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。

NIRF淋巴顯像能實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)顯示淋巴系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)及功能，較好地揭示各級(jí)淋巴水腫患者的顯像特點(diǎn)及與疾病病程的關(guān)系，對(duì)肢體淋巴水腫具有較好的診斷價(jià)值。然而，本研究例數(shù)過少，不能揭示各級(jí)淋巴水腫的淋巴引流速度及推進(jìn)間隔時(shí)間的差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故需要進(jìn)一步行大樣本臨床研究。

[1] Sevick-Muraca EM, Rasmussen JC. Molecular imaging w ith optics: primer and case for near-infrared fluorescence techniques in personalized medicine. J Biomed Opt, 2008, 13(4): 041303.

[2] Hirche C, Murawa D, Mohr Z, et al. ICG fluorescenceguided sentinel node biopsy for axillary nodal staging in breast cancer. Breast Cancer Res Treat, 2010, 121(2): 373-378.

[3] Sevick-Muraca EM, Sharma R, Rasmussen JC, et al. Imaging of lymph flow in breast cancer patients after microdose adm inistration of a near-infrared fluorophore: feasibility study. Radiology, 2008, 246(3): 734-741.

[4] Hirche C, Dresel S, Krempien R, et al. Sentinel node biopsy by indocyanine green retention fluorescence detection for inguinal lymph node staging of anal cancer: prelim inary experience. Ann Surg Oncol, 2010, 17(9): 2357-2362.

[5] Murawa D, Hirche C, Dresel S, et al. Sentinel lymph node biopsy in breast cancer guided by indocyanine green fluorescence. Br J Surg, 2009, 96(11): 1289-1294.

[6] Unno N, Inuzuka K, Suzuki M, et al. Prelim inary experience w ith a novel fluorescence lymphography using indocyanine green in patients w ith secondary lymphedema. J Vasc Surg, 2007, 45(5): 1016-1021.

[7] Sharma R, Wang W, Rasmussen JC, et al. Quantitative imaging of lymph function. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2007, 292(6): H3109-H3118.

[8] Sharma R, Wendt JA, Rasmussen JC, et al. New horizons for imaging lymphatic function. Ann N Y Acad Sci, 2008, 1131(5): 13-36.

[9] Tiwari A, Cheng KS, Button M, et al. Differential diagnosis, investigation, and current treatment of lower limb lymphedema. Arch Surg, 2003, 138(2): 152-161.