劉福林,周玉娟,劉 莉,許金鵬

(1河北大學(xué)附屬醫(yī)院,河北保定 071000;2河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

胰島素樣生長因子-1(IGF-1)是由70個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的單鏈蛋白,編碼基因在人類定位于 12號染色體。IGF-1可與IGF-1受體(IGF-1R)及其結(jié)合蛋白(IGFBP)結(jié)合。IGF-1的作用受IGFBP、p13-kinase、蛋白激酶C、IL-1等多種活性因子的影響[1]。IGF-1具有細(xì)胞分化、增殖功能和胰島素樣代謝作用。在動脈粥樣硬化(AS)的發(fā)生發(fā)展中,IGF-1涉及到平滑肌細(xì)胞增殖遷移、脂質(zhì)沉積、炎癥反應(yīng)、血管再生及細(xì)胞外基質(zhì)重組等。本研究觀察了IGF-1對兔動脈粥樣硬化血管壁平滑肌細(xì)胞(VSMC)凋亡的影響?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物和飼料 健康日本大耳白兔共 24只,雌雄不限,體質(zhì)量 2.5～3.8 kg。普通飼料配方為標(biāo)準(zhǔn)兔飼料,高脂飼料配方為標(biāo)準(zhǔn)兔飼料92.0%、膽固醇2.0%、花生油6.0%。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物、試劑 IGF-1,辛伐他汀。總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)試劑盒。TUNEL試劑盒,DAB試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物分組 將 24只日本大耳白兔分籠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為正常組、模型組、IGF-1組及陽性對照(辛伐他汀)組,各6只。

1.2.2 兔動脈粥樣硬化模型制作及取材 每日上午將高脂飼料喂給模型組、IGF-1組及辛伐他汀組白兔(2.5 mg/kg),正常組白兔喂給相應(yīng)劑量的普通飼料。高脂飼料喂養(yǎng) 1周后,模型組、IGF-1組及辛伐他汀組行股動脈內(nèi)膜剝脫術(shù),剝脫腹主動脈、股動脈、骼動脈內(nèi)皮;正常組家兔麻醉后切開皮膚,分離股動脈,結(jié)扎近端血管,不做內(nèi)皮剝脫。模型組術(shù)后繼續(xù)給予高脂飼料,IGF-1組及辛伐他汀組術(shù)后分別給予高脂飼料加0.1 mg/ml的IGF-1因子0.1 ml腹腔注射、辛伐他汀懸濁液按2.5mg/kg(辛伐他汀片碾碎制成1 mg/ml的懸濁液)經(jīng)胃管灌胃。正常組術(shù)后普通飼料喂養(yǎng)加等劑量生理鹽水灌胃。12周后實(shí)驗(yàn)兔用25%烏拉坦4ml/kg經(jīng)耳緣靜脈注射麻醉,沿正中線剪開,腹腔靜脈取血,離心分離血清, -20℃保存,用于血脂檢測。在相同部位取一段長約1 cm的腹主動脈,冷生理鹽水沖洗,15%中性甲醛固定,石蠟包埋,切片后行凋亡細(xì)胞檢測。

1.2.3 血脂測定 用生化分析儀測定TC、TG、LDL、HDL。

1.2.4 血管壁凋亡細(xì)胞檢測 采用TUNEL法。石蠟包埋的切片預(yù)處理后,滴加50μl的Tunel反應(yīng)混合溶液,在濕盒中37℃孵育60min后加入50μl轉(zhuǎn)化劑,37℃孵育30 min。PBS沖洗3次,加入50～100μl的DAB底物溶液,室溫孵育10 min,PBS沖洗 3次。蘇木素復(fù)染細(xì)胞核,封片,光鏡下分析圖像。在高倍視野下每張切片隨機(jī)選 5個(gè)視野,用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng),計(jì)算5個(gè)視野的Tunel陽性細(xì)胞數(shù),計(jì)算陽性細(xì)胞百分比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。多組間比較用單因素方差分析;兩組間比較,方差齊用LSD方法,方差不齊則用Dunnett T3方法。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血脂檢測結(jié)果 各組血脂檢測結(jié)果比較見表1。

表1 各組血脂檢測結(jié)果比較(mm ol/L,±s)

表1 各組血脂檢測結(jié)果比較(mm ol/L,±s)

注：與模型組相比,＊P＜0.05;與辛伐他汀組相比,△P＜0.05

組別 TC TG HDL LDL正常組 5.52±3.28＊ 0.67±0.24＊△ 0.89±0.71＊△ 1.71±1.25＊△模型組 27.17±10.66△ 2.01±0.57 3.24±0.27 12.48±3.54△IGF-1組 26.11±2.70△ 1.05±0.37 3.32±0.01 14.20±1.81△辛伐他汀組 11.28±4.17＊ 1.48±0.33 2.38±0.63 5.65±1.88＊

2.2 凋亡細(xì)胞檢測結(jié)果 正常組、模型組、IGF-1組、辛伐他汀組的凋亡細(xì)胞分別為 0.148%± 0.095%、40.167%±8.931%、6.333%±4.546%、44.833%±12.687%;模型組與正常組及IGF-1組相比,P均＜0.05;辛伐他汀組與正常組及IGF-1組相比,P均＜0.05。

3 討論

研究[2]表明,生長激素、IGF-1軸對物質(zhì)代謝起著重要的作用。IGF-1通過降低生長激素、升調(diào)胰島素受體等途徑增加臟器、組織對胰島素的敏感性,調(diào)節(jié)糖、脂代謝。人出生后隨年齡的增長,血清IGF-1水平緩慢升高,50歲以后,血清IGF-1水平有一個(gè)緩慢下降的趨勢。劉岳鴻等[3]研究發(fā)現(xiàn),老年人生長激素、IGF-1軸的活性下降可以導(dǎo)致血糖、血脂的異常,可能是糖尿病、動脈粥樣硬化、冠心病等疾病發(fā)生發(fā)展的原因之一。

在AS初期,血管平滑肌細(xì)胞過度增殖是AS形成的重要步驟。血管壁細(xì)胞數(shù)量增多、內(nèi)膜增厚、管腔變窄,除了與VSMC過度增殖有關(guān),還與其凋亡率下降導(dǎo)致的細(xì)胞累積、數(shù)量增多密切相關(guān)[4]。因此,在病變初期調(diào)節(jié)VSMC凋亡可能成為抗AS的途徑之一。他汀類藥物可以誘導(dǎo)VSMC凋亡,減輕早期AS后的內(nèi)膜增厚,預(yù)防血管再狹窄。

在AS進(jìn)展期及后期,VSMC凋亡是導(dǎo)致粥樣斑塊破裂引發(fā)心血管事件的首要原因。首先,大量的VSMC凋亡可導(dǎo)致基質(zhì)Ⅰ型膠原的合成減少,使斑塊纖維帽變薄,造成斑塊不穩(wěn)定,易發(fā)生破裂,引起嚴(yán)重的臨床并發(fā)癥[5]。其次,凋亡的 VSMC不易清除,殘余部分成為鈣化基質(zhì)囊泡的主要來源,引起斑塊鈣化。另外,VSMC凋亡的早期磷酸烯醇丙酮酸鹽暴露于細(xì)胞表面,在凝血因子Ⅴ、Ⅶ的參與下,可作為血栓形成的底物激活血小板而引起血栓形成[6]。最后,VSMC凋亡可導(dǎo)致IL-1及IL-8釋放和單核細(xì)胞趨化蛋白-1上調(diào),引起過多的巨噬細(xì)胞趨化,而殘余物質(zhì)的清除未見增加,巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的機(jī)體活性氧簇(ROS)及分泌的巨噬細(xì)胞—集落刺激因子和TNF-α又促進(jìn)VSMC的凋亡,形成惡性循環(huán)[7]。IGF-1通過抑制VSMC凋亡來穩(wěn)定粥樣斑塊,減少AS晚期炎癥、鈣化、血栓形成。

AS的高危因素如高脂血癥、高血壓、糖尿病及其并發(fā)癥等與 IGF-1表達(dá)密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn), IGF-1對AS有一定的防治作用,并能在AS形成晚期維持斑塊穩(wěn)定性,其機(jī)制可能與減少VSMC凋亡有關(guān),為臨床上試用人重組IGF-1治療AS等相關(guān)疾病提供了理論依據(jù)。

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