重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis,SAP）是消化系統(tǒng)常見的危重癥疾病之一。有研究表明腸神經(jīng)系統(tǒng)（ENS）在胃腸動力衰竭中起一定作用。本研究擬測定大鼠胃排空率及胃竇肌間神經(jīng)叢一氧化氮合酶（NOS）陽性神經(jīng)元的數(shù)目變化,探討SAP對胃竇肌間神經(jīng)叢NOS陽性神經(jīng)元的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）動物：成年SD雄性大鼠30只（由桂林醫(yī)學(xué)院動物實驗室提供）,體質(zhì)量220～250g。隨機(jī)分為兩組,假手術(shù)組10只,模型組20只。（2）試劑：牛磺膽酸鈉（Sigma公司）,Anti-Human Neuronal Protein HuC/HuD（anti-HuC/HuD,MolecularProbes公司）,NOS1（R-20,Santa Cruz公司）,TRITC標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）、FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L）（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）,酚紅糊劑（0.4%酚紅試液按每15mL加1g面粉的比例加熱調(diào)成糊劑,天津科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心）,NaOH、Ba（OH）2·8H2O、ZnSO4廣東汕頭西隴化工有限公司）等。（3）儀器：解剖顯微鏡（stemi 2000-CS,SIP NO.MIC 00945,蔡司光學(xué)儀器上海國際貿(mào)易有限公司）,Olympus正置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯儀器公司）,L1braS32PC紫外分光光度計（Biochrom公司）等。

1.2 方法

1.2.1 SAP模型的建立 造模前大鼠禁食24h,可自由飲水,術(shù)前4h禁水,予25%氨基乙酸4mL/kg腹腔內(nèi)注射麻醉,開腹,辨認(rèn)胰膽管及十二指腸乳頭開口處；在腸系膜對側(cè)腸壁上選一無血管區(qū),用磨去針尖的四號半針頭經(jīng)十二指腸乳頭開口處滑行探入胰膽管,順其走向推進(jìn)4～5mm后,用動脈夾夾住胰膽管開口處及近肝門部膽管,接微量泵逆行泵入5%?；悄懰徕c（1mL/kg,0.1mL/min）2～3min,即可見胰腺充血、水腫、胰膽管擴(kuò)張,停止泵入牛磺膽酸鈉,維持8～10min后,松開動脈夾、拔針,將腸管復(fù)位,分層關(guān)腹；術(shù)后皮下補(bǔ)液（生理鹽水10mL）。

1.2.2 胃排空率的檢測 造模 24h后,灌入酚紅糊（1mL/100g）,20min后處死大鼠,結(jié)扎胃賁門與幽門,取胃,順胃大彎縱向剪開,在冷0.85%NaCl溶液中洗脫酚紅糊分裝于試管中,洗脫液6mL加0.3mol/L Ba（OH）2溶液和5%Zn-SO4溶液各2mL,充分混勻,3000r/min離心10min,取4mL上清液加入10%NaOH 0.5mL混合,用紫外分光光度計于560nm比色,測吸光度,即為胃中酚紅吸光度（OD）值,計算胃酚紅殘留率,以胃酚紅殘留率為指標(biāo)評價胃排空率。另取0.4%酚紅1mL,加蒸餾水1mL,以10%NaOH 0.5mL的OD為標(biāo)準(zhǔn)值計算胃排空率（%）,胃排空率（%）=（1-樣品OD560/標(biāo)準(zhǔn)OD560）×100%。

1.2.3 胃竇肌間神經(jīng)叢標(biāo)本的制作 （1）具體步驟：將剪開的胃再次用冰Kreb液沖洗干凈,使?jié){膜面朝上,平鋪并適當(dāng)伸展固定于木板上,用Stefanini固定液4℃固定24h；PBS緩沖液沖洗后,將胃竇部修剪成約0.4cm×0.8cm大小,將漿膜、肌層一同撕下,去掉附著的斜行肌、環(huán)行肌纖維,充分暴露肌間神經(jīng)叢,將標(biāo)本貼附于載玻片上,即制成標(biāo)本。（2）雙重免疫熒光染色：將制備好的胃肌間神經(jīng)叢標(biāo)本用含0.5%Triton X-100、10%正常山羊封閉血清的PBS室溫孵育30～60min；anti-HuC/HuD（10μ g/mL）4℃孵育 24h；NOS1（R-20，1∶100）4℃孵育24h；FITC標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG（1∶100）22℃孵育45min；TRITC標(biāo)記山羊抗兔IgG（1∶200）22℃孵育45min；甘油封片。每一道程序后均用PBS洗滌3次,每次10min。（3）染色結(jié)果判斷：用Hu蛋白為神經(jīng)元標(biāo)志物顯示所有神經(jīng)元,用NOS1（R-20）顯示陽性神經(jīng)元；用TRITC（紅）、FITC（綠）標(biāo)記的二抗顯示不同的一抗；用熒光顯微鏡觀察并計數(shù)各自陽性細(xì)胞數(shù),計算每200個神經(jīng)元細(xì)胞中NOS神經(jīng)元陽性細(xì)胞所占百分比。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。分別進(jìn)行正態(tài)分布檢驗,然后進(jìn)行t檢驗,數(shù)據(jù)以±s表示,檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況 假手術(shù)組大鼠一般狀況較好,術(shù)后無死亡發(fā)生。模型組大鼠一般狀況差,出現(xiàn)精神萎靡、反應(yīng)遲鈍、懶動、呼吸急促等表現(xiàn),6h死亡2只,12h死亡5只,24h死亡11只。

2.2 兩組大鼠胃排空率比較 見表1。

2.3 胰腺組織大體改變 模型組誘導(dǎo)10min胰腺呈現(xiàn)廣泛被膜下出血水腫,24h胰腺組織廣泛出血壞死,范圍擴(kuò)大,胰腺周圍大網(wǎng)膜及腹膜有較多皂化斑點(diǎn),腹腔內(nèi)大量血性腹腔積液。術(shù)后剖腹見假手術(shù)組胰腺肉眼觀察呈淡粉紅色,顏色均勻一致。

2.4 組織病理學(xué)觀察 模型組胰腺腺泡細(xì)胞腫脹,可見灶性壞死,腺泡細(xì)胞間有大量炎細(xì)胞浸潤；小葉排列紊亂,其間充斥炎性滲出；壞死區(qū)內(nèi)腺泡結(jié)構(gòu)消失；葉間隙增寬,間質(zhì)微血管破裂,紅細(xì)胞溢出。假手術(shù)組除部分胰腺腺泡細(xì)胞水腫外,小葉結(jié)構(gòu)存在,間質(zhì)清晰,間質(zhì)內(nèi)偶見炎細(xì)胞浸潤,見表1、封4圖1。

表1 兩組大鼠各項指標(biāo)測定結(jié)果比較（±s）

表1 兩組大鼠各項指標(biāo)測定結(jié)果比較（±s）

*：P＜0.05,**：P＜0.01與假手術(shù)組比較。

組別 n 胰腺組織病理評分（分）NOS陽性神經(jīng)元的表達(dá)（%）胃排空率（%）假手術(shù)組10 1.7±0.7 17.03±4.15 71.58±3.89模型組 9 15.6±1.2* 25.19±2.84* 31.33±6.30**

2.5 大鼠胃竇肌間神經(jīng)叢標(biāo)本染色情況 熒光顯微鏡觀察大鼠胃竇肌間神經(jīng)叢主要由神經(jīng)元和神經(jīng)纖維構(gòu)成。全層標(biāo)本經(jīng)anti-HuC/HuD染色后觀察,神經(jīng)元胞體形態(tài)多樣,呈卵圓形、三角形及不規(guī)則形,大小不一；胞質(zhì)、胞核均染為綠色,神經(jīng)纖維不著色。標(biāo)本經(jīng)NOS1（R-20）染色后觀察,神經(jīng)元胞體大小不等,形態(tài)多樣；胞質(zhì)呈紅色,胞核不著色,神經(jīng)纖維著色呈網(wǎng)格狀分布。NOS陽性神經(jīng)元所占比例明顯增加。與胃竇肌間神經(jīng)叢相比,回腸神經(jīng)元細(xì)胞較小,多呈條索樣分布,神經(jīng)纖維多呈“井”字分布,而結(jié)腸處于兩者之間,見封4圖2。

3 討論

SAP是臨床上消化系統(tǒng)疾病常見的急危重癥之一。胃腸運(yùn)動障礙是SAP的重要表現(xiàn)。ENS是控制胃腸運(yùn)動的一個獨(dú)立的整合系統(tǒng)。NOS神經(jīng)元是來自ENS的主要抑制性神經(jīng)元,分泌的一氧化氮（NO）具有重要的松弛胃腸道平滑肌作用。NOS是NO合成的限速酶。NOS抑制劑可清除壓力誘導(dǎo)的胃容受性舒張,說明NO能誘導(dǎo)胃舒張,抑制胃的運(yùn)動[1],有研究表明迷走神經(jīng)切斷后胃電頻率及正常電活動百分?jǐn)?shù)較對照組顯著下降,提示迷走神經(jīng)對胃肌電活動的影響可能是由傳出纖維介導(dǎo)[2]。神經(jīng)型一氧化氮合酶（nNOS）被發(fā)現(xiàn)沉積在小鼠胃迷走神經(jīng)傳入末梢,NO抑制上皮神經(jīng)調(diào)節(jié)作用與選擇性作用于迷走神經(jīng)末梢有關(guān)[3]。NO還參與胃慢波的調(diào)控[4]。胃動素（motilin,M TL）是胃竇Ⅲ相移行運(yùn)動復(fù)合波（MMC）的啟動因素[5],胃壁和十二指腸肌間神經(jīng)叢中發(fā)現(xiàn)有M TL陽性神經(jīng)元和神經(jīng)纖維[6]。大部分的MTL受體（68.9%）為nNOS陽性神經(jīng)元[7],胃竇肌間神經(jīng)叢多為 nNOS陽性神經(jīng)元[8],相關(guān)實驗也證實SAP大鼠結(jié)腸的NOS陽性神經(jīng)元細(xì)胞增多[9]。但SAP胰腺組織以結(jié)構(gòu)型一氧化氮合酶（cNOS）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）升高為主[10]。已有研究發(fā)現(xiàn)SAP患者血清NO水平升高[11],而血清中的NO部分來源于ENS,本研究結(jié)果證實SAP大鼠胃竇nNOS陽性神經(jīng)元增多,推測胃竇肌間神經(jīng)叢NOS陽性神經(jīng)元參與了ENS的重塑。但SAP胃運(yùn)動障礙受多因素影響,其機(jī)制仍不完全清楚。

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