殷宗寶,鄧 超,李 英,李海軍,陳栩栩,程啟慧

（海南省?？谑腥嗣襻t(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科 570208）

細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)在特發(fā)性肺纖維化（IPF）的發(fā)生中發(fā)揮重要作用,這些細(xì)胞因子能影響疾病過程中纖維化的進(jìn)程,一些細(xì)胞因子在調(diào)節(jié)及維持肺纖維化過程中具有決定性作用[1]。甘草酸二銨具有較強(qiáng)的非特異性的抗炎作用,其抗炎作用與皮質(zhì)醇類似,可減少肝細(xì)胞的水腫、壞死,同時(shí)甘草酸二銨調(diào)節(jié)內(nèi)源性類固醇水平,而無鹽皮質(zhì)激素樣不良反應(yīng)[2]。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)甘草酸二銨這一藥理作用探討其對(duì)肺纖維化的治療作用及對(duì)細(xì)胞因子的影響,以期為臨床防治肺纖維化奠定良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑 甘草酸二銨為江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品,國(guó)藥準(zhǔn)字H10940191,生產(chǎn)批號(hào)2000011504；注射用鹽酸博萊霉素為日本化藥株式會(huì)社產(chǎn)品,進(jìn)口許可證號(hào)X20000349；地塞米松磷酸鈉注射液為西南藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品,國(guó)藥準(zhǔn)字H50021463,生產(chǎn)批號(hào)2000020604；濃縮型兔抗大鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）抗體和γ干擾素（IFN-γ）抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品；即用型SABC試劑盒（兔IgG）和DAB顯色試劑盒為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；大鼠TGF-β1、白細(xì)胞介素4（IL-4）和IFN-γELISA試劑盒為美國(guó)Rapid Bio公司產(chǎn)品。

1.2 動(dòng)物來源及分組 健康清潔級(jí)雄性大鼠40只（5周齡）,合格證號(hào)：SCXK0020158,體質(zhì)量（180±20）g,由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；隨機(jī)分為對(duì)照組、博萊霉素致肺纖維化組（模型組）、地塞米松治療組（DXM組）和甘草酸二銨治療組（甘草酸二銨組）共4組,每組10只,常規(guī)喂養(yǎng)。

1.3 造模方法 參照文獻(xiàn)[3]的方法,對(duì)大鼠氣道內(nèi)滴注博萊霉素致肺纖維化模型的方法略作改進(jìn)。對(duì)照組以等量的生理鹽水代替博萊霉素氣管內(nèi)滴注。甘草酸二銨組和DXM組于造模后第28天開始,分別給已制成的肺纖維化動(dòng)物模型連續(xù)14d腹腔內(nèi)注射甘草酸二銨150mg·kg-1·d-1和地塞米松注射液3mg·kg-1·d-1（濃度5mg/mL）,第43天全部處死。

1.4 標(biāo)本采集 大鼠血清采集：2%戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射麻醉,仰臥位開腹腔,取腹主動(dòng)脈近心端斷端全血6～8mL,室溫靜置2h后,3000r/min離心15min,取上層血清保存-70℃冰箱中備用。取大鼠左肺下葉和右肺下葉1cm×1cm×l cm大小的組織,固定于10%甲醛溶液中,分別用于免疫組化檢測(cè)和病理組織學(xué)觀察。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1 普通病理觀察 肺組織常規(guī)HE染色。肺組織切片肺泡炎按Khalin等[4]標(biāo)準(zhǔn)判斷。-：無肺纖維化；+：輕度肺纖維化,受累面積少于全肺20%；++：中度肺纖維化,受累面積占20%～50%；+++：重度肺纖維化,受累面積大于50%,肺泡結(jié)構(gòu)紊亂。

1.5.2 肺免疫組化檢測(cè) IFN-γ、TGF-β1檢測(cè)按免疫組化試劑盒（SABC法）說明書進(jìn)行。TGF-β1在博萊霉素致肺纖維化大鼠肺組織中的不同部位表達(dá)情況定量分析,據(jù)IHC染色程度分為4級(jí)：不顯色為陰性（-）；顯色稍深于背景,淺棕色為弱陽性（+）；顯色部位與背景明顯區(qū)別,棕色為陽性（++）；顯色部位深度著色,深棕色為強(qiáng)陽性（+++）。肺組織TGF-β1的IHC表達(dá)結(jié)果用SPOT及IPP圖像采集分析系統(tǒng)處理,40× 10視野下觀察采集圖像,用Image-Pro Plus6.0版專業(yè)圖像分析軟件處理結(jié)果,以累積光密度值（IOD）表示TGF-β1表達(dá)的相對(duì)強(qiáng)度,每張切片選5個(gè)免疫反應(yīng)較強(qiáng)視野進(jìn)行分析。IFN-γ在博萊霉素致肺纖維化大鼠肺組織中的不同部位表達(dá)情況定量分析方法與TGF-β1的定量分析方法相同。

1.5.3 大鼠血清TGF-β1、IL-4、IFN-γ的測(cè)定 采用雙抗體夾心ELISA法,按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 資料采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料以±s表示,組間比較采用多組間的方差分析（F檢驗(yàn)）,如差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,再進(jìn)行組間兩兩比較,用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理變化 普通病理觀察：對(duì)照組未出現(xiàn)明顯的病理變化（封3圖1）。模型組肺泡壁增厚,肺纖維化程度重,肺泡結(jié)構(gòu)破壞,肺泡腔消失（封3圖2）。甘草酸二銨組肺泡腔內(nèi)殘留少量炎性細(xì)胞,肺組織結(jié)構(gòu)比較完整,無肺纖維化形成（封3圖3）。DXM組肺組織病理變化基本同甘草酸二銨組。對(duì)照組大鼠幾乎無肺泡炎及肺纖維化發(fā)生。模型組造模后第43天肺纖維化廣泛形成；甘草酸二銨組和DXM組比模型組大鼠肺纖維化發(fā)生率低,且程度輕,見表1。

表1 各組大鼠肺纖維化分級(jí)

2.2 肺組織TGF-β1和IFN-γ的表達(dá) 對(duì)照組只有較大血管、支氣管壁的平滑肌細(xì)胞TGF-β1呈中度陽性反應(yīng),其余細(xì)胞均為弱陽性反應(yīng)。模型組病變區(qū)有少許炎癥細(xì)胞,肺泡間質(zhì)中TGF-β1陽性反應(yīng)的成纖維細(xì)胞、肌纖維母細(xì)胞等間質(zhì)細(xì)胞明顯,陽性反應(yīng)增強(qiáng),并可見沉積的細(xì)胞外間質(zhì)呈片塊狀、粗條索狀陽性著色（封3圖4）；甘草酸二銨組和DXM組TGF-β1陽性反應(yīng)細(xì)胞較少,基本為弱陽性反應(yīng)（封3圖5）。模型組細(xì)胞間質(zhì)IFN-γ陽性反應(yīng)較弱,而甘草酸二銨組和DXM組IFN-γ陽性反應(yīng)較強(qiáng)（封3圖6）,見表2。

表2 肺內(nèi)間質(zhì)TGF-β1和IFN-γ的定量表達(dá)（IOD±s）

表2 肺內(nèi)間質(zhì)TGF-β1和IFN-γ的定量表達(dá)（IOD±s）

●：P＜0.01,與模型組比較；★：P＜0.05,與DXM組比較。

組別 TGF-β1 IFN-γ對(duì)照組 13.47±6.86● 11.99±6.92●模型組 18.07±5.81 9.42±3.67DXM組 10.50±5.15● 13.85±7.48●甘草酸二銨組 13.60±5.90●★ 14.49±5.79●F 11.24 3.45P 0.000 0.018

2.3 大鼠血清TGF-β1、IL-4和IFN-γ含量 各組大鼠血清標(biāo)本TGF-β1、IL-4和IFN-γ含量見表3。模型組大鼠血清IL-4和TGF-β1含量高于其他組,DXM組與甘草酸二銨組血清TGF-β1含量相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.169）。DXM組、甘草酸二銨組血清IL-4含量?jī)蓛上啾炔町愐矡o統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。甘草酸二銨組血清IFN-γ含量最高,但與DXM組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.389）,兩組與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P值分別為0.000、0.001。

表3 各組大鼠血清TGF-β1、IL-4和IFN-γ含量±s,pg/mL,n=10）

表3 各組大鼠血清TGF-β1、IL-4和IFN-γ含量±s,pg/mL,n=10）

●：P＜0.01,與模型組比較；★：P＞0.05,與DXM組比較。

組別 TGF-β1 IL-4 IFN-γ對(duì)照組 0.71±0.26● 11.31±3.60● 53.89±28.38●模型組 1.55±1.06 27.27±15.97 11.33±10.49DXM組 0.95±0.50● 16.08±5.59● 54.48±23.83●甘草酸二銨組 0.48±0.14●★ 8.73±4.20●★ 63.47±19.93●★F 3.99 4.52 7.85P 0.017 0.014 0.001

3 討論

TGF-β1是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞活動(dòng)的多功能調(diào)節(jié)肽,在纖維化大鼠肺內(nèi)主要由肺泡巨噬細(xì)胞分泌,它能夠從周圍組織中募集成纖維細(xì)胞并能刺激未成熟成纖維細(xì)胞增生和分化[4-5]。還能刺激成纖維細(xì)胞大量合成膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型,尤其是Ⅳ型膠原蛋白,以增加肺間質(zhì)的膠原成分,同時(shí)還可抑制膠原蛋白酶及纖溶酶原激活物的合成,增加蛋白酶抑制物的形成,以減少肺間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解,造成細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)控失衡,引起肺纖維化。

IL-4一方面激活 T淋巴細(xì)胞分化為 Th2并促使其產(chǎn)生IL-4、IL-5,這些細(xì)胞因子再次作用于T淋巴細(xì)胞,并抑制Th1細(xì)胞形成和分泌IL-2、IFN-γ和TNF-β等細(xì)胞因子；另一方面誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞合成膠原,刺激細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的表達(dá),調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化,并在調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答方面發(fā)揮重要作用[6]。

IFN-γ可抑制Th0細(xì)胞向 Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)化,同時(shí)抑制 Th2細(xì)胞合成和分泌細(xì)胞因子如IL-4、IL-5等,削弱IL-4使成纖維細(xì)胞活化為具有纖維化活性的肌成纖維細(xì)胞這一效應(yīng),從而拮抗其致纖維化活性。它對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,如膠原、纖維連接蛋白等的生成也有顯著的抑制作用。有實(shí)驗(yàn)證明IFN-γ可以下調(diào)小鼠巨噬細(xì)胞中TGF-β1的過度表達(dá),從而下調(diào)前膠原的表達(dá),使間質(zhì)中膠原積聚減少[7]。因此,細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)能影響IPF疾病過程中成纖維細(xì)胞的活化、增殖及膠原的沉積[3]。

甘草酸二銨是從藥用植物甘草根、莖中提取的一種有效的活性成分,具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、影響內(nèi)源性類固醇激素和保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)等廣泛的藥理學(xué)作用[8]。有研究表明甘草酸二銨可以抑制活化的巨噬細(xì)胞分泌炎性因子,如IL-4、TGF-β1等[9]；還可以抑制嗜酸性粒細(xì)胞活化趨化因子的分泌,而嗜酸性粒細(xì)胞活化趨化因子可以募集嗜酸性粒細(xì)胞并促進(jìn)其分泌其他的炎癥因子,如IL-4、IL-5、TGF-β1等[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,甘草酸二銨組大鼠HE染色顯示細(xì)胞基膜完好,成纖維細(xì)胞的增生及間質(zhì)膠原纖維的沉積范圍及程度顯著小于模型組；免疫組化檢測(cè)表明肺組織內(nèi)TGF-β1陽性反應(yīng)細(xì)胞較少,基本為弱陽性反應(yīng),強(qiáng)度和范圍顯著小于模型組,這與葉進(jìn)燕等[2]報(bào)道類似；而IFN-γ陽性反應(yīng)細(xì)胞較多,較模型組表達(dá)明顯。甘草酸二銨組大鼠血清中TGF-β1、IL-4含量明顯較模型組低,而IFN-γ則相反。因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明甘草酸二銨可以促進(jìn)大鼠肺組織分泌IFN-γ,抑制IL-4、TGF-β1的生成,具有較強(qiáng)的抗肺纖維化作用。雖然甘草酸二銨組與DXM組相比在以上因子的表達(dá)方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但甘草酸二銨無鹽皮質(zhì)激素樣不良反應(yīng)。

[1]Lukacs NW,Hogaboam C,Chensue SW,et al.Type l/type 2cytokine paradigm and the progression of pulmonary fibrosis[J].Chest,2007,120（1Suppl）：S5-8.

[2]葉進(jìn)燕,陳少賢,徐紅蕾,等.甘草甜素對(duì)大鼠肺纖維化的治療作用及對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2006,9（29）：636-637.

[3]Luppi F,Cerri S,Beghe B,et al.Corticosteoid and immunomodulatory agents in idiopathic pulmonary fibrosis[J]. Res Pir M ed,2004,98（11）：1035-1044.

[4]Khalin N,Berezay O,Sporn M,et al.Macrophage production of transforming growth factor β1and collagen synthesis in chronic pulmonary inflammation[J].J Exp Med，2005,170（3）：723-737.

[5]Denis M,Ghadirian E.Transforming growth factor-β generated in the course of hypersensitivity pneumonitis：contribution to collagen sythesis[J].Am J Respir Cell Biol，2004,7（2）：156-160.

[6]Paul WE.Interleukin-4：a prototypic immunoregulatorylymphokine[J].Blood,2001,77（9）：1859-1870.

[7]Eickelberg O,Pansky A,Koehler E,et al.M olecularmechanisms of TGF（betta）antagonism by interferon-γand cycloporine A in lung fibrosis[J].Chest,2001,15（3）：797-806.

[8]丁旭春,王新華,王真.復(fù)方甘草甜素治療博萊霉素致肺纖維化大鼠的研究[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2008,17（27）：4237-4238.

[9]Kato T,Horie N,Hashimoto K,et al.Bimodal effect of glycyrrhizin on macrophage nitric oxide and prostaglandin E2production[J].In Vivo,2008,22（5）：583-586.

[10]Javaprakasam B,Duddaqa S,Wang R,et al.Licorice flavonoids inhibit evtaxin-1secretion by human fetal lung fibroblasts in vitro[J].J Aqric Food Chem,2009,57（3）： 820-825.