佘巍巍,曾錦榮,王昌明,蔡雙啟

（1.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科,廣西541001；2.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科,南寧531001）

支氣管哮喘與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的研究一直備受國(guó)內(nèi)外學(xué)者的普遍關(guān)注,有必要從基因水平研究神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）調(diào)控免疫細(xì)胞因子表達(dá)的機(jī)制。NGF不僅是神經(jīng)系統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)因子[1],由于其能夠高效地調(diào)控炎癥細(xì)胞因子的作用而受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是一種具有廣泛生物學(xué)活性的前炎癥細(xì)胞因子,TNF-α能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子,促進(jìn)炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)與活化,刺激血小板活化因子、白三烯等炎癥介質(zhì)的合成,從而導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性。本研究擬通過(guò)建立大鼠哮喘模型來(lái)研究NGF與TNF-α的關(guān)系及各自在哮喘氣道炎癥中的作用,并探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡清潔級(jí)雌性SD大鼠30只,按隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（A組）、哮喘組（B組）、NGF干預(yù)組（C組）,每組10只。

1.2 哮喘模型的建立及抗NGF干預(yù) A組：致敏過(guò)程以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替卵清蛋白（OVA）注射,激發(fā)過(guò)程以鹽水霧化吸入,相關(guān)參數(shù)與B組相同；B組哮喘模型的構(gòu)建方法于實(shí)驗(yàn)第1天、第14天致敏,即OVA 20μ g由1mg氫氧化鋁乳化后,腹腔注射200μ L。第21～27天,將大鼠置于密閉容器內(nèi),以超聲霧化器霧化3%OVA鹽水氣溶膠并對(duì)其進(jìn)行吸入激發(fā),每天1次,每次30min。C組哮喘模型建立同B組,但于每次激發(fā)前3h,先經(jīng)鼻滴入抗大鼠β-NGF抗體（稀釋1∶50）50μ L,每日1次,連續(xù)7d。各組大鼠均于末次激發(fā)后24h處死,取組織標(biāo)本進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。并通過(guò)肺功能檢測(cè)、HE染色觀察肺組織病理變化、BALF炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)等多方面來(lái)證實(shí)模型的成功建立。

1.3 肺組織病理標(biāo)本制作[2]灌洗后經(jīng)氣管向右肺注入4%多聚甲醛使胸膜展平后,置4%多聚甲醛中固定,常規(guī)石蠟包埋,切片,厚度約5μ m,HE染色,顯微鏡下觀察支氣管、肺組織病理特征。

1.4 免疫組織化學(xué) 石蠟切片經(jīng)常規(guī)處理后,滴加正常山羊血清室溫封閉20min,然后按親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物（ABC）法進(jìn)行免疫組織化學(xué)反應(yīng)。陰性對(duì)照組用PBS代替上述抗體。

1.5 原位分子雜交 石蠟切片經(jīng)常規(guī)處理后,按經(jīng)典方法進(jìn)行原位分子雜交。陰性對(duì)照用PBS代替上述抗體。用原位分子雜交比較3組TNF-α水平,RT-PCR半定量法測(cè)定大鼠肺組織NGF mRNA表達(dá),Western-blot法檢測(cè)3組NGF蛋白水平變化。

1.6 結(jié)果判定 觀察NGF、TNF-α及 NGF mRNA、TNF-α mRNA在肺組織的表達(dá),并用顯微圖像分析系統(tǒng)測(cè)定8個(gè)視野的陽(yáng)性系數(shù)和灰度值。陽(yáng)性系數(shù)的計(jì)算參照文獻(xiàn)[1]的方法。NGF、TNF-α及其NGF mRNA、TNF-αmRNA陽(yáng)性細(xì)胞均以胞質(zhì)著色為主,陽(yáng)性顆粒呈棕褐色或棕黃色。

2 結(jié)果

2.1 NGF蛋白及NGF mRNA的表達(dá) B組大鼠肺組織及其周圍可見(jiàn)大量的NGF蛋白及NGF mRNA陽(yáng)性細(xì)胞,而C組則明顯減少,A組大鼠僅見(jiàn)少量陽(yáng)性細(xì)胞,見(jiàn)封2圖1。B組大鼠肺組織NGF蛋白、NGF mRNA的平均灰度值（待測(cè)物質(zhì)灰度值越高,表明其在細(xì)胞中表達(dá)的量越低,反之,灰度值越低表明其在細(xì)胞中表達(dá)的量越高）分別為145±7、128±7；A組分別為189±7、191±6；C組分別為156±6、139±8,3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=19.50、P＜0.01；t=15.90、P＜0.01；t= 14.89、P＜0.01）；各組大鼠肺組織NGF蛋白平均陽(yáng)性系數(shù)B組大于A組,且C組小于B組,3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t =1.29、P＜0.01；t=3.85、P＜0.01；t=2.19、P＜0.01）；其NGFmRNA平均陽(yáng)性系數(shù)為B組小于A組,且C組大于B組,3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.24、P＜0.01；t=3.65、P＜0.01；t=2.14、P＜0.01）,見(jiàn)封2圖2。其陽(yáng)性產(chǎn)物平均灰度值,見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠肺組織NGF蛋白及NGF mRNA平均陽(yáng)性系數(shù)（平均秩）及平均灰度值比較

2.2 TNF-α蛋白及TNF-αmRNA的表達(dá) B組大鼠TNF-α蛋白及TNF-αmRNA的灰度值分別為141±7、127±7；A組分別為175±8、179±9；C組分別為164±8、155±6；3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=28.40、P＜0.01；t=22.22、P＜0.01）。各組大鼠肺組織中TNF-α蛋白平均陽(yáng)性系數(shù)為B組大于A組,且C組小于B組,3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.61、P＜0.01；t=3.80、P＜0.01；t=2.35、P＜0.01）；其TNF-αmRNA平均灰度值為B組大于A組,且C組小于B組,3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.47、P＜0.01；t=3.81、P＜0.01；t= 2.19、P＜0.01）,見(jiàn)表2。B、C組血清TNF-α水平明顯高于A組（P＜0.05）；C組血清TNF-α水平低于B組（P＜0.05）。見(jiàn)封2圖3。

表2 各組大鼠肺組織TNF-α蛋白及TNF-αmRNA平均陽(yáng)性系數(shù)（平均秩）及平均灰度值比較

3 討論

支氣管哮喘是一種氣道炎癥性疾病,其炎癥發(fā)生與調(diào)控氣道的神經(jīng)系統(tǒng)之間存在復(fù)雜的相互作用。氣道神經(jīng)激活和氣道上皮的相互作用在其中起著重要作用[3]。已有研究表明,支配氣道的感覺(jué)神經(jīng)及其相關(guān)營(yíng)養(yǎng)因子可能與氣道炎癥的形成密切相關(guān),并提出了氣道神經(jīng)源性炎癥學(xué)說(shuō)[4-5]。眾多的實(shí)驗(yàn)證明哮喘狀態(tài)下NGF及其受體表達(dá)升高[6-7],在哮喘患者血清和支氣管肺泡灌洗液中NGF的水平明顯升高[8],同時(shí),國(guó)內(nèi)外有許多資料均已證實(shí)TNF-α對(duì)氣道炎癥具有促進(jìn)作用[9-10]。哮喘組大鼠血清、TNF-α濃度較正常對(duì)照組增高,通過(guò)趨化激活中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞共同參與氣道炎癥的形成,在氣道炎癥的持續(xù)和放大中起到重要作用,說(shuō)明其在氣道炎癥發(fā)病中具有重要意義。在炎癥情況下,TNF-α和NGF相互之間有何影響？正是本實(shí)驗(yàn)要探討的癥結(jié)所在。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了哮喘大鼠肺組織TNF-αmRNA的表達(dá),并觀察了拮抗NGF作用后哮喘大鼠TNF-α表達(dá)的變化。發(fā)現(xiàn)哮喘大鼠肺組織TNF-αmRNA的表達(dá)及血清 TNF-α水平均較正常對(duì)照組增高,而應(yīng)用了抗NGF抗體拮抗了NGF作用后TNF-α表達(dá)水平下降。由此,可判斷哮喘大鼠炎癥發(fā)作可能是由于肺組織TNF-αmRNA表達(dá)增加,TNF-α生成增多所致。阻斷內(nèi)源性NGF可降低哮喘大鼠肺組織TNF-αmRNA的表達(dá),提示NGF可能通過(guò)調(diào)節(jié)TNF-α的表達(dá)參與哮喘發(fā)病。NGF可能通過(guò)增進(jìn)肺組織TNF-αmRNA的表達(dá)作為參與哮喘的發(fā)病機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與正常大鼠比較,哮喘大鼠肺組織（主要為免疫炎性細(xì)胞和氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞）中NGF蛋白及NGF mRNA表達(dá)顯著增加,說(shuō)明哮喘狀態(tài)下NGF增高主要是由于支氣管、肺組織細(xì)胞合成增加所致,同時(shí)還發(fā)現(xiàn),拮抗NGF生物活性則能夠有效抑制TNF-α的合成和分泌。從本研究結(jié)果可推測(cè),哮喘氣道神經(jīng)源性炎癥發(fā)病機(jī)制中可能存在一個(gè)循環(huán)作用鏈：氣道上皮、支氣管、肺組織炎性細(xì)胞（嗜酸性粒細(xì)胞等）合成NGF增加,合成的NGF刺激細(xì)胞合成TNF-α增多,TNF-α再作用于氣道效應(yīng)細(xì)胞（上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等）而觸發(fā)氣道神經(jīng)源性炎性反應(yīng),反過(guò)來(lái),炎性反應(yīng)又可以顯著上調(diào)肺組織NGF的表達(dá),從而形成惡性循環(huán),拮抗NGF生物活性則能夠有效抑制TNF-α的合成和分泌,達(dá)到減輕哮喘氣道高反應(yīng)等病理生理改變的目的。在國(guó)外研究中,Silvestri等[11]報(bào)道哮喘發(fā)作期患者TNF-α水平明顯高于緩解期及對(duì)照組患者,而且哮喘病情越嚴(yán)重,持續(xù)時(shí)間越長(zhǎng),血清 TNF-α濃度越高；反之,病情越輕,持續(xù)時(shí)間越短,血清TNF-α濃度越低。Bonini等[12]在其研究中發(fā)現(xiàn),哮喘患者血清NGF水平增高,且過(guò)敏性哮喘患者血清NGF水平比非過(guò)敏性哮喘患者高。對(duì)過(guò)敏性哮喘小鼠進(jìn)行抗NGF處理,可明顯減輕哮喘引起的氣道高反應(yīng)性。

綜上所述,NGF可以通過(guò)調(diào)節(jié)合成和分泌TNF-α表達(dá)參與哮喘神經(jīng)源性炎性反應(yīng)而在哮喘氣道炎癥中發(fā)揮作用；同時(shí)抗NGF干預(yù)可下調(diào)TNF-αmRNA表達(dá)和蛋白分泌水平,減輕哮喘氣道炎癥,參與哮喘的整個(gè)病理生理過(guò)程,從而有利于對(duì)于哮喘氣道炎癥的控制,因而能為哮喘防治提供新的思路。

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