李書(shū)鉞

(林同棪國(guó)際工程咨詢(中國(guó))有限公司， 重慶 401121)

0 引 言

隨著現(xiàn)代經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，隨之也引發(fā)了一些負(fù)面影響，其中環(huán)境問(wèn)題尤為嚴(yán)重，因此對(duì)污染物的毒性鑒定顯得十分重要.就此問(wèn)題，分析工作者研究采用各種生物方法來(lái)檢測(cè)水質(zhì)毒性，包括微生物、藻、底棲軟體動(dòng)物、浮游生物、魚(yú)等，其中發(fā)光細(xì)菌因其獨(dú)特的生理發(fā)光特性以及與現(xiàn)代光電檢測(cè)手段完美結(jié)合的特點(diǎn)而得到了人們廣泛的關(guān)注.Hastings最先提出了發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光機(jī)制，發(fā)光細(xì)菌在20世紀(jì)30年代首先用于快速評(píng)價(jià)藥物的毒性作用.1978年美國(guó)Beckman儀器公司研制了生物發(fā)光光度計(jì)，即Microtox系統(tǒng).目前，許多國(guó)家如加拿大、法國(guó)、意大利、美國(guó)已將發(fā)光細(xì)菌方法作為標(biāo)準(zhǔn)的毒性測(cè)試方法.采用發(fā)光細(xì)菌作為毒性測(cè)試的指標(biāo)生物的生物毒性檢測(cè)儀，以其結(jié)果可靠、操作方法簡(jiǎn)便和經(jīng)濟(jì)耗費(fèi)低等優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)成為水質(zhì)毒性檢測(cè)研究的主要方向[1-3]，我國(guó)也于1995年將這一方法列為環(huán)境毒性檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法( GB/T 15441-1995)[4].但是，由于受到發(fā)光細(xì)菌生長(zhǎng)周期的限制，使得現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)與實(shí)際水質(zhì)毒性存在較大的人為誤差，再者由于很多儀器敏感元件需要與毒性物質(zhì)接觸，從而大大縮短了儀器使用壽命.本研究采用光纖傳導(dǎo)，以明亮發(fā)光桿菌為指示生物，將發(fā)光細(xì)菌制成生物膜組件，這樣可以使檢測(cè)系統(tǒng)與分析系統(tǒng)相分開(kāi)，不僅能夠延長(zhǎng)儀器的使用壽命，還能夠?qū)崿F(xiàn)急性毒性的連續(xù)檢測(cè)，大大方便了發(fā)光細(xì)菌傳感器在現(xiàn)場(chǎng)的應(yīng)用，也為研制在線檢測(cè)傳感器奠定了基礎(chǔ).

1 發(fā)光細(xì)菌傳感器的原理及結(jié)構(gòu)

1.1 發(fā)光細(xì)菌傳感器的原理

發(fā)光細(xì)菌通過(guò)其正常新陳代謝產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，在條件一定的情況下，發(fā)光較為穩(wěn)定，并且在有外在毒性物質(zhì)存在的情況下，發(fā)光變化較為顯著.其代謝反應(yīng)過(guò)程可以簡(jiǎn)要概括為[5]：

FMNH2+RCHO→FMN+RCOOH+H2O+hv

該反應(yīng)是在發(fā)光細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)由細(xì)菌熒光酶素催化，黃素單核苷酸(FMNH2)、長(zhǎng)鏈脂肪酸(RCHO)、氧氣(O2)發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生波長(zhǎng)約為480 nm的藍(lán)綠光.當(dāng)發(fā)光細(xì)菌與外來(lái)毒性物質(zhì)接觸一段時(shí)間后，其發(fā)光強(qiáng)度有明顯的變化.通常情況下，發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度與毒性物質(zhì)的毒性大小呈負(fù)相關(guān)的關(guān)系.Thomulka 認(rèn)為,外來(lái)受試物通過(guò)下面兩個(gè)途徑抑制細(xì)菌發(fā)光: (1) 外在毒物直接抑制發(fā)光反應(yīng)酶活性，從而影響代謝反應(yīng)；(2) 外在毒物通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)與發(fā)光反應(yīng)有關(guān)的其他代謝過(guò)程(如細(xì)胞呼吸等)間接影響發(fā)光代謝反應(yīng)[6].基于以上原理，利用發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度與毒性物質(zhì)的毒性大小呈負(fù)相關(guān)的關(guān)系，可以研制檢測(cè)水質(zhì)毒性的發(fā)光細(xì)菌傳感器.

1.2 發(fā)光細(xì)菌傳感器系統(tǒng)結(jié)構(gòu)概述

本設(shè)計(jì)將發(fā)光細(xì)菌固定成便于攜帶、安裝與保存的生物膜組件，使其與經(jīng)過(guò)預(yù)處理的外來(lái)毒物在反應(yīng)室內(nèi)反應(yīng)15 min，產(chǎn)生光信號(hào)變化；微弱的發(fā)光細(xì)菌光信號(hào)通過(guò)多模光纖傳輸至高靈敏度的光電轉(zhuǎn)換器，本研究采用光電倍增管R105(北京濱松電子)實(shí)現(xiàn)光信號(hào)與電信號(hào)的轉(zhuǎn)換；然后通過(guò)高精度放大器件OP124制成放大電路將微弱電信號(hào)放大到0～5 V，OP124運(yùn)算放大器屬于高精度、低溫漂、電流噪聲低類型的放大器，是電流電壓轉(zhuǎn)換核心器件；本設(shè)計(jì)采用了巴特沃斯低通濾波器，截止頻率為30 kHz,以消除外界信號(hào)的干擾.最后通過(guò)數(shù)據(jù)采集卡對(duì)信號(hào)進(jìn)行采集、處理以及進(jìn)行受試物的毒性評(píng)估[7].如圖1所示.

圖1 發(fā)光細(xì)菌傳感器系統(tǒng)組成

本設(shè)計(jì)以明亮發(fā)光桿菌為指示生物，其發(fā)射光為藍(lán)綠色熒光,光譜范圍420～670 nm ，波峰位置λmax在475～485 nm 左右.首先，將明亮發(fā)光桿菌固定成直徑為2 cm的生物膜組件，將其放入暗盒中，生物膜組件與光纖之間的距離為2 mm，在閉光的情況下通過(guò)檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度的變化值.采用劑量-效應(yīng)實(shí)驗(yàn)方法對(duì)毒性進(jìn)行評(píng)估,發(fā)光細(xì)菌組件與受試物反應(yīng)15 min后，發(fā)光量減弱到50%時(shí)的受試物濃度(50%)，即為EC50值.實(shí)際檢測(cè)通過(guò)相對(duì)發(fā)光量來(lái)反映污染物的急性毒性：

RLU=Vp/Vu×100%

式中：RLU為相對(duì)發(fā)光度；Vp加受試物細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度；Vu對(duì)照發(fā)光強(qiáng)度.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 儀器

R105光電倍增管(北京濱松電子有限公司)、WLQ蠕動(dòng)泵、暗盒式流通池、光纖、WC109-05恒溫器、RS9901生物發(fā)光儀(上海容圣生物電子公司)、VC9807勝利數(shù)字萬(wàn)用表.

2.2 菌種及培養(yǎng)基

明亮發(fā)光桿菌(Photobacteriumphosphorreum)購(gòu)自南京土壤所.

ASW培養(yǎng)基(W/V):胰蛋白胨(0.5%),酵母浸出汁(0.5%),氯化鈉(3%),磷酸氫二鈉(0.5%),磷酸二氫鉀(0.1%),甘油(0.3%),瓊脂粉(1.5%),pH 7.0.

2.3 受試物

Pb(NO3)2、CdCl2·3H2O、K2Cr2O7、Hg(NO3)2、CuSO4·5H2O,所用試劑均為分析純.

2.4 生物膜組件的構(gòu)建

首先將細(xì)菌進(jìn)行斜面培養(yǎng)，從斜面接菌種于ASW培養(yǎng)液中, 20 ℃恒溫, 200 r/min搖床培養(yǎng)15 h, 使菌數(shù)達(dá)到108～109個(gè)/mL.首先采用尼龍材質(zhì)網(wǎng)制成直徑為2 cm的生物膜組件骨架，然后采用海藻酸鈉包埋法制備生物膜組件[8]，將30 g/L的海藻酸鈉溶液與等體積的108個(gè)/ mL的菌液緩慢混合在一起，混合均勻后，用注射器吸取0.8 mL的混合物均勻注入到尼龍網(wǎng)上面，固定成直徑為2 cm的均勻圓片[9]；將圓片浸在0.3 mg/L的CaCl2溶液中約20 min，使其充分固定.此生物膜組件限一次使用，保存在4 ℃條件下，使用時(shí)采用新鮮培養(yǎng)基復(fù)蘇，復(fù)蘇時(shí)間為20 min.

圖2 反應(yīng)室示意圖

2.5 發(fā)光細(xì)菌傳感器的組裝

構(gòu)建生物傳感器反應(yīng)室，如圖2所示.將制備好的生物膜組件插入傳感器預(yù)留孔中構(gòu)成反應(yīng)室，生物膜組件與蠕動(dòng)泵、光纖、暗盒、計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)構(gòu)成發(fā)光細(xì)菌傳感器.此系統(tǒng)設(shè)計(jì)首先采用固定化技術(shù)將明亮發(fā)光桿菌固定成生物膜圓片，并將生物膜圓片插入傳感器反應(yīng)室預(yù)留孔中，通過(guò)光纖傳輸變化的微弱光信號(hào)，光纖距生物膜間距為3 mm.采用高靈敏度光電轉(zhuǎn)化器件光電倍增管和高精度運(yùn)算放大器將電流信號(hào)轉(zhuǎn)化為電壓信號(hào)并放大.設(shè)計(jì)濾波電路，截止頻率為30 kHz，以減少外界信號(hào)對(duì)微弱信號(hào)的干擾.最后，通過(guò)計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)將電信號(hào)轉(zhuǎn)化為模擬信號(hào)并運(yùn)算輸出.傳感器結(jié)構(gòu)示意圖如圖3所示，用蠕動(dòng)泵吸取受試物，生物組件與受試物接觸15 min后光電檢測(cè)器件即開(kāi)始檢測(cè).

圖3 發(fā)光細(xì)菌傳感器示意圖

3 結(jié)果與討論

3.1 檢測(cè)條件的選擇

3.1.1 pH與溫度

在20 ℃條件下，反應(yīng)池分別通入pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的未加受試物的底液，測(cè)得的發(fā)光變化值見(jiàn)表1.

由表1可見(jiàn)，受試物的pH值對(duì)毒性測(cè)定影響較大，過(guò)酸或過(guò)堿都會(huì)影響細(xì)菌的發(fā)光，這主要是由于過(guò)酸或過(guò)堿影響了發(fā)光細(xì)菌的代謝過(guò)程，使發(fā)光細(xì)菌不能正常代謝，導(dǎo)致發(fā)光量下降甚至發(fā)光猝滅.pH值在7.0左右時(shí)發(fā)光細(xì)菌發(fā)光量較為穩(wěn)定，故設(shè)定測(cè)量最適pH值為7.0.

在pH值為7.0的條件下，分別通入溫度為10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃的3% NaCl溶液，測(cè)得的發(fā)光變化值見(jiàn)表2.

表1 不同pH底液時(shí)細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度

表2 不同溫度底液時(shí)細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度

表3 不同反應(yīng)時(shí)間細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度

由表2可見(jiàn)，受試物的溫度對(duì)毒性測(cè)定影響較大，溫度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響細(xì)菌的發(fā)光，這主要是由于溫度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響發(fā)光細(xì)菌反應(yīng)酶的活性，使發(fā)光細(xì)菌不能正常代謝，導(dǎo)致發(fā)光量下降甚至發(fā)光猝滅.溫度值在20 ℃時(shí)發(fā)光細(xì)菌發(fā)光量較為穩(wěn)定，故設(shè)定測(cè)量最適溫度值為20 ℃.

3.1.2 檢測(cè)時(shí)間的確定

在上述確定條件下，以0.15 mg/L Hg(Ⅱ)為受試物，測(cè)定發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化，結(jié)果見(jiàn)表3.

如表3所示，發(fā)光細(xì)菌發(fā)光量變化經(jīng)歷了先下降后平穩(wěn)的過(guò)程，在15 min時(shí)降為初始值的一半，相對(duì)偏差為2%.在5 min后下降變得緩慢，為了兼顧檢測(cè)速度與靈敏度，并與標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法做比較[10]，我們將檢測(cè)時(shí)間定為15 min，相對(duì)偏差為2%.

3.1.3 底液流速的確定

在上述確定條件下，以0.15 mg/L Hg(Ⅱ)為受試物，測(cè)定發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化，結(jié)果見(jiàn)表4.

表4 不同底液流速細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度

由表4可見(jiàn)，底液流速過(guò)高或過(guò)低都不利于發(fā)光細(xì)菌毒性檢測(cè)，底液流速過(guò)低，發(fā)光細(xì)菌所感受到的毒性物量不足；流速過(guò)高，毒性物質(zhì)對(duì)發(fā)光細(xì)菌的毒性過(guò)大，較難真實(shí)反應(yīng)細(xì)菌發(fā)光量受毒性抑制的情況，故設(shè)定底液流速為3 mL/min.

3.2 重金屬污染物毒性測(cè)定

在上述確定實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)Hg2+、 Cd2+、 Cr6+、Pb2+、 Cu2+的急性毒性進(jìn)行了研究，將受試物用3%的NaCl溶液配成5個(gè)濃度梯度，如表5所示，攪拌均勻.以3% NaCl溶液做空白對(duì)照,每個(gè)濃度梯度設(shè)3個(gè)平行.取培養(yǎng)15 h后的菌液制成發(fā)光細(xì)菌生物膜組件，并用蠕動(dòng)泵將受試物通入進(jìn)水通道，用生物毒性測(cè)試儀測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度.用直線內(nèi)插法求出相對(duì)發(fā)光量為50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的毒性物質(zhì)濃度，即為該毒物對(duì)發(fā)光細(xì)菌半數(shù)發(fā)光抑制濃度(EC50)[11].每個(gè)濃度梯度設(shè)3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，標(biāo)準(zhǔn)偏差低于10%.

表5 受試物測(cè)試濃度

表6 受試物線形方程及相關(guān)系數(shù)

利用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理.

以離子濃度計(jì)算Pb2+、Cr6+、Cd2+、Hg2+、Cu2+對(duì)發(fā)光細(xì)菌的EC50,結(jié)果分別為16.55 mg/L、4.6 mg/L、10.53 mg/L、0.15 mg/L、19.06 mg/L，對(duì)發(fā)光菌的急性毒性從大至小依次為Hg2+> Cd2+> Cr6+> Pb2+> Cu2+.實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用線形回歸分析方法[12]，結(jié)果如表6所示.

如表6所示，重金屬對(duì)發(fā)光細(xì)菌毒性的大小順序?yàn)镠g2+> Cr6+> Cd2+> Pb2+>Cu2+，毒性的大小順序與采用國(guó)標(biāo)推薦的方法測(cè)得的結(jié)果有很好的一致性.經(jīng)分析，有可能是發(fā)光細(xì)菌的熒光酶受到金屬離子的負(fù)作用后抑制了發(fā)光細(xì)菌的正常代謝作用，導(dǎo)致發(fā)光量下降[13].

表7 傳感器系統(tǒng)穩(wěn)定性的測(cè)定

3.3 傳感器系統(tǒng)穩(wěn)定性的測(cè)定

選擇檢測(cè)條件pH值為7.0、溫度為20 ℃、測(cè)定時(shí)間為15 min、底液流速為3 mL/min.以Hg2+、 Cd2+為受試物，受試濃度分別為0.15 mg/L、10.53 mg/L，測(cè)定其相對(duì)發(fā)光量.設(shè)5個(gè)平行試驗(yàn)，分別編號(hào)1，2，3，4，5組.

如表7所示，Hg2+、 Cd2+在pH值為7.0、溫度為20 ℃、測(cè)定時(shí)間為15 min、底液流速為3 mL/min條件下，以濃度分別為0.15 mg/L、10.53 mg/L測(cè)定其發(fā)光量在0.5左右，標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4.41%、6.11%，具有較好穩(wěn)定性，說(shuō)明以上測(cè)量數(shù)據(jù)具有較高的可信度.

4 結(jié) 論

(1)該儀器符合國(guó)家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局、國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局頒布的《GB/T1544121995 水質(zhì)急性毒性的測(cè)定:發(fā)光細(xì)菌法》的測(cè)試方法，適合多種有毒化合物廢水生物毒性的測(cè)定，可廣泛應(yīng)用于水質(zhì)急性毒性的研究.

(2)該儀器采用了便于攜帶、安裝和保存的生物膜組件，大大提高了現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的效率，為研究在線水質(zhì)急性毒性檢測(cè)系統(tǒng)奠定了基礎(chǔ).

(3)該儀器設(shè)計(jì)檢測(cè)與分析系統(tǒng)分開(kāi)，延長(zhǎng)了儀器的使用壽命，文中較為具體的分析了其使用條件，能夠準(zhǔn)確的檢測(cè)水質(zhì)毒性.

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