龐萬(wàn)勇，賀爭(zhēng)鳴，何 誠(chéng)，朱德生，趙德明

（1.賽諾菲研發(fā)中心藥物安全評(píng)價(jià)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部，北京 100022；2.中國(guó)食品藥品檢定院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理處，北京 100050；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193；4.北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，北京 100876）

近幾十年來(lái)，實(shí)驗(yàn)鼠種群的總體健康水平得到了顯著的提高，但還是有很多對(duì)人類(lèi)和/或動(dòng)物健康以及對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究有影響的病原體在實(shí)驗(yàn)鼠群中流行。實(shí)驗(yàn)小鼠大概占到生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物總數(shù)的80～90％，尤其基因工程鼠的使用成對(duì)數(shù)增長(zhǎng)。疾病的發(fā)生和流行受到遺傳學(xué)、環(huán)境因素（如飼料、墊料、傳染病等）等的影響?；蚬こ淌笠?yàn)槠溥z傳改變所以其免疫狀況和對(duì)傳染性疾病和其它疾病的易感性和臨床表現(xiàn)都可能和其它普通的實(shí)驗(yàn)鼠不一樣。因此基因工程鼠群的健康管理更復(fù)雜更具挑戰(zhàn)性。因?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物的健康狀況會(huì)直接或間接地影響到科學(xué)研究，所以對(duì)任何實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施而言，動(dòng)物健康質(zhì)量控制規(guī)劃，或簡(jiǎn)單稱(chēng)之為動(dòng)物健康監(jiān)測(cè)，都是很重要的。

1 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)鼠群健康監(jiān)測(cè)的必要性

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的健康狀況會(huì)影響到其在科研中的使用，對(duì)科研本身、人類(lèi)健康（如人畜共患?。┖蛯?shí)驗(yàn)動(dòng)物種群都有可能造成影響。實(shí)驗(yàn)大、小鼠的傳染性病原體一般不會(huì)造成明顯的臨床疾病，但多造成亞臨床感染，個(gè)別病原體的強(qiáng)毒株除外。亞臨床感染雖然不引起明顯的臨床病癥和死亡，但是這些感染對(duì)生理學(xué)、免疫學(xué)、甚或形態(tài)學(xué)的影響都可能影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的科學(xué)性、真實(shí)性和可重復(fù)性。例如小鼠肝炎病毒感染，在免疫學(xué)方面，因?yàn)椴《驹诰奘杉?xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞內(nèi)增殖所以會(huì)影響到這些細(xì)胞的功能、可激活自然殺傷細(xì)胞并誘導(dǎo)干擾素的生成、可造成免疫刺激或抑制（因感染時(shí)機(jī)不同而異）、減少脾細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞因子的生成、永久性地降低皮膚移植排斥反應(yīng)、并在疾病恢復(fù)后永久性降低T細(xì)胞依賴(lài)性的抗體應(yīng)答。在微生物學(xué)方面，降低對(duì)病毒如仙臺(tái)病毒和鼠肺炎病毒的易感性、增強(qiáng)對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌的抵抗性。在生理學(xué)方面，改變肝臟酶的水平和蛋白合成、改變外周血計(jì)數(shù)、增強(qiáng)單核細(xì)胞的促凝血活性、降低NOD小鼠糖尿病的發(fā)生率。在腫瘤學(xué)方面，改變腫瘤傳代間隔和腫瘤侵襲性、污染移植性腫瘤等。亞臨床感染需要用靈敏的和精確的監(jiān)測(cè)方法進(jìn)行確定。實(shí)驗(yàn)鼠群健康管理的一個(gè)首要目標(biāo)就是確定種群中存在或不存在某些特定的病原體，所以健康監(jiān)測(cè)有時(shí)可稱(chēng)為微生物監(jiān)測(cè)。

現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)鼠群存在的有些傳染性病原可能是因?yàn)榕c人類(lèi)接觸或由野生鼠污染所致，所以一種或多種新的或已從種群中凈化出去的病原體重新入侵的風(fēng)險(xiǎn)依然存在。因此建立并執(zhí)行全面的種群健康監(jiān)測(cè)對(duì)于確保人類(lèi)健康、動(dòng)物健康福利、以及實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果的有效性和可重復(fù)性是非常重要的。

2 實(shí)驗(yàn)鼠群健康監(jiān)測(cè)規(guī)程的建立

首先要做好風(fēng)險(xiǎn)分析。實(shí)驗(yàn)機(jī)構(gòu)需要了解在其設(shè)施里飼養(yǎng)和使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有哪些品種及其健康狀況如何、有無(wú)和有哪些基因工程鼠、過(guò)去/現(xiàn)在和未來(lái)會(huì)有什么研究項(xiàng)目涉及到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用和生物材料的使用、實(shí)驗(yàn)設(shè)施的類(lèi)型（屏障或普通環(huán)境、以及人流、物流、動(dòng)物流和氣流等）、生物安全措施（包括實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)商的遴選、不同種屬的和不同來(lái)源的動(dòng)物分開(kāi)飼養(yǎng)、隔離檢疫、生物材料的微生物污染監(jiān)測(cè)、蟲(chóng)害控制措施等）、既往健康問(wèn)題、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)商的動(dòng)物健康狀況、引入新動(dòng)物或生物材料的頻度、（單位內(nèi)外的）動(dòng)物運(yùn)輸情況等。然后還要通過(guò)文獻(xiàn)查詢(xún)、專(zhuān)家咨詢(xún)等途徑了解當(dāng)前在實(shí)驗(yàn)鼠群所流行的疾病，主要側(cè)重于傳染性疾病，特別是相關(guān)品系或基因工程鼠對(duì)相關(guān)疾病的易感性、病理學(xué)、臨床表現(xiàn)和對(duì)科研的影響。這樣才能分析出傳染性病原體入侵實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施的隱患大小，以及入侵后是否能和如何限制或根除感染。

其次是要對(duì)監(jiān)測(cè)項(xiàng)目即病原進(jìn)行選擇。在選擇病原之前，應(yīng)該了解選擇病原進(jìn)行監(jiān)測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)或理由。理論上講，應(yīng)該選取可影響到科研以及動(dòng)物和人的健康的病原（如人畜共患病病原）進(jìn)行監(jiān)測(cè)，尤其是那些如果檢測(cè)到以后可以采取措施控制最好是能根除的病原?？梢岳斫鉃槿绻仨毐O(jiān)測(cè)的病原監(jiān)測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，但是又沒(méi)有將其根除的辦法，則可不再監(jiān)測(cè)或減少監(jiān)測(cè)頻度（如果依據(jù)法律法規(guī)必須強(qiáng)制性監(jiān)測(cè)的話）。另外也應(yīng)該考慮到所涉及動(dòng)物的微生物等級(jí)。例如，悉生動(dòng)物應(yīng)該檢測(cè)所有的外源性微生物。無(wú)特定病原體動(dòng)物應(yīng)該按照相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)（在中國(guó)主要的依據(jù)是現(xiàn)行版的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)》國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)）來(lái)監(jiān)測(cè)，如不應(yīng)該有外寄生蟲(chóng)、多細(xì)胞的體內(nèi)寄生蟲(chóng)、以及致病性的腸道原蟲(chóng)。另外不應(yīng)該有大多數(shù)外源病毒感染或沒(méi)有針對(duì)它們的抗體，因?yàn)椴《径技纳诩?xì)胞內(nèi)會(huì)影響細(xì)胞的代謝和功能并影響機(jī)體的防御機(jī)制。對(duì)細(xì)菌的監(jiān)測(cè)要依動(dòng)物的免疫狀況而定，如無(wú)免疫缺陷的動(dòng)物只要沒(méi)有少數(shù)的“原發(fā)性”細(xì)菌病原就可適用于絕大多數(shù)的研究，但對(duì)于免疫缺陷動(dòng)物而言則還要監(jiān)測(cè)那些條件性病原菌甚至于監(jiān)測(cè)“正常菌群”中的個(gè)別細(xì)菌，因?yàn)樗鼈兛赡芤鹈庖呷毕輨?dòng)物的疾病。關(guān)于應(yīng)該監(jiān)測(cè)或不監(jiān)測(cè)哪些病原，國(guó)際上現(xiàn)在尚無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，這也是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)商和使用單位之間經(jīng)常討論的一個(gè)熱點(diǎn)問(wèn)題。相關(guān)病原的監(jiān)測(cè)與否請(qǐng)參考相關(guān)指南，如美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院出版的由日美科學(xué)家編撰的“Manual of Microbiologic Monitoring of Laboratory Animals”、歐洲實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)聯(lián)盟（FELASA）的相關(guān)指南、美國(guó)密蘇里大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物疾病診斷實(shí)驗(yàn)室（RADIL）和美國(guó)Charles River Laboratories的相關(guān)網(wǎng)站，可作為參考。北美的大多數(shù)研究機(jī)構(gòu)對(duì)常見(jiàn)的病毒至少每季度監(jiān)測(cè)一次，然后每年度進(jìn)行完全的病毒監(jiān)測(cè)，并對(duì)細(xì)菌進(jìn)行選擇性監(jiān)測(cè)。對(duì)寄生蟲(chóng)的監(jiān)測(cè)，一般是每季度作內(nèi)部監(jiān)測(cè)，或使用第三方實(shí)驗(yàn)室做年度檢測(cè)。歐洲的情況也大體差不多，或者說(shuō)對(duì)核心的重要的病原的監(jiān)測(cè)在國(guó)際上都比較一致。每個(gè)單位應(yīng)該建立一份具有單位特色的清單，列出實(shí)驗(yàn)設(shè)施里不應(yīng)該有的或者說(shuō)應(yīng)該排除的病原，即應(yīng)該進(jìn)行監(jiān)測(cè)的病原清單。這種清單，不是一成不變的，而應(yīng)該是與時(shí)俱進(jìn)的，因?yàn)椴粩嘤行碌牟≡霈F(xiàn)也會(huì)有老的病原發(fā)生新的變化。因?yàn)橛泻芏嚓P(guān)于病毒致病性及其對(duì)科研影響的文獻(xiàn)，所以病毒的清單一般比較好建立。雖然有的病毒可能不致病，但通行的共識(shí)是實(shí)驗(yàn)鼠群不應(yīng)該有病毒感染。一個(gè)問(wèn)題就是有無(wú)必要對(duì)一些已經(jīng)早就從實(shí)驗(yàn)鼠群根除的病毒，如小鼠胸腺病毒、鼠多瘤病毒等，進(jìn)行監(jiān)測(cè)。比較保險(xiǎn)的做法是進(jìn)行監(jiān)測(cè)，但監(jiān)測(cè)頻率可依監(jiān)測(cè)陰性結(jié)果而酌情遞減。關(guān)于寄生蟲(chóng)，對(duì)其是否對(duì)研究有影響及影響大小知之甚少。但寄生蟲(chóng)的檢出可揭示動(dòng)物種群的清潔狀況差，或揭示屏障體系有疏漏或與野鼠有直接或間接的接觸（如非致病性鞭毛蟲(chóng)如毛滴蟲(chóng)），因此常常應(yīng)該監(jiān)測(cè)寄生蟲(chóng)并從種群中凈化出去。有關(guān)細(xì)菌的選取則很復(fù)雜，與病毒不同的是，我們經(jīng)常通過(guò)評(píng)估其能否導(dǎo)致病變或臨床癥狀的能力來(lái)認(rèn)定細(xì)菌對(duì)于實(shí)驗(yàn)鼠的重要性，這是因?yàn)槲覀儗?duì)大多數(shù)細(xì)菌對(duì)宿主造成其它影響和干擾研究的“潛能”知之甚少。而且，目前對(duì)于眾多的嚙齒類(lèi)動(dòng)物的細(xì)菌如嗜肺巴氏桿菌和巴氏桿菌屬的其它成員（如鼠放線桿菌、鼠流感嗜血桿菌）的分類(lèi)和鑒定的認(rèn)識(shí)尚有諸多不足，所以難免造成誤判，而且由于對(duì)它們的特性了解不多，因此妨礙了凈化效率。有研究表明鼠的某些生長(zhǎng)因子依賴(lài)性的巴氏桿菌與副流感嗜血桿菌密切相關(guān)（因此其傳播可能源于人類(lèi)）。尚不清楚是否可以將這些細(xì)菌從實(shí)驗(yàn)鼠群中根除，因?yàn)槠琳显O(shè)施生產(chǎn)的鼠會(huì)接觸到人類(lèi)，因此有再感染的風(fēng)險(xiǎn)。另外人類(lèi)是大腸桿菌、克雷伯氏菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌等的宿主，所以也會(huì)有人將這些細(xì)菌傳播給鼠的可能性。有些細(xì)菌可能在實(shí)驗(yàn)鼠群中不常見(jiàn)，如念珠狀鏈桿菌，許多設(shè)施都監(jiān)測(cè)該菌，這是因?yàn)樵摼鹨环N叫做鼠咬熱的人畜共患病，而且可作為衡量是否有野大鼠污染的標(biāo)志。再如卡氏肺孢子蟲(chóng)在實(shí)驗(yàn)大鼠群中存在，而且并不少見(jiàn)，是所謂的“大鼠呼吸病毒”病的真正病原。先前該病原主要通過(guò)組織病理學(xué)診斷和監(jiān)測(cè)，現(xiàn)在可以通過(guò)血清學(xué)和PCR監(jiān)測(cè)了。

第三要考慮監(jiān)測(cè)的頻度。微生物監(jiān)測(cè)的頻度應(yīng)該適宜，以便及時(shí)地發(fā)現(xiàn)設(shè)施里是否有不應(yīng)該有的病原。監(jiān)測(cè)的頻度主要取決于所要監(jiān)測(cè)的種群的用途、某一或某些病原或污染物對(duì)該種群的重要性、病原侵入的風(fēng)險(xiǎn)以及經(jīng)費(fèi)上的考慮。例如FELASA建議對(duì)重要病原至少每季度監(jiān)測(cè)一次。大多實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)供應(yīng)商則監(jiān)測(cè)得更頻繁些，如每4～6周一次。在經(jīng)常引入新動(dòng)物的設(shè)施，與不常有新進(jìn)動(dòng)物的設(shè)施相比較，則監(jiān)測(cè)頻度可能要適度地提高。一般性的原則是高頻度的小樣本監(jiān)測(cè)（如每4～6周檢測(cè)3～5個(gè)動(dòng)物）比低頻度的大樣本監(jiān)測(cè)（如每3個(gè)月監(jiān)測(cè)10個(gè)動(dòng)物）更可靠。對(duì)于常見(jiàn)的或?qū)ρ芯坑袊?yán)重影響的病原如冠狀病毒、細(xì)小病毒、肺炎支原體、蟯蟲(chóng)等應(yīng)該頻繁監(jiān)測(cè)，如每季度甚至每月一次；而對(duì)于不常見(jiàn)的病原如小鼠巨細(xì)胞病毒、仙臺(tái)病毒、漢坦病毒等則不必頻繁監(jiān)測(cè)，如可每半年甚至每年一次。對(duì)于隔離器中飼養(yǎng)的無(wú)菌動(dòng)物或悉生動(dòng)物來(lái)說(shuō)，應(yīng)該更頻繁地監(jiān)測(cè)細(xì)菌（環(huán)境微生物）而不是病毒和寄生蟲(chóng)，因?yàn)橐坏┢琳铣霈F(xiàn)問(wèn)題，細(xì)菌侵入的風(fēng)險(xiǎn)更大。例如可在一年中的第1、2和3季度送哨兵鼠的血清進(jìn)行常見(jiàn)病原的血清學(xué)檢測(cè)，在第4季度則送檢活體哨兵鼠進(jìn)行全面的檢測(cè)。

第四要考慮健康監(jiān)測(cè)的內(nèi)容和范疇。如果動(dòng)物種群中至少有一個(gè)動(dòng)物存在有某病原體，那么健康監(jiān)測(cè)的目的就是在抽的樣本中檢測(cè)出有該病原的存在。反之亦然，即如果在抽樣中沒(méi)檢測(cè)出病原則種群中不存在該病原。健康監(jiān)測(cè)體系包含以下范疇：對(duì)種群中的動(dòng)物進(jìn)行監(jiān)測(cè)或?qū)ι诒鴦?dòng)物進(jìn)行監(jiān)測(cè)，后者可稱(chēng)為哨兵鼠計(jì)劃，也是我們通常所說(shuō)的（狹義的）健康監(jiān)測(cè)。其次，是對(duì)新引進(jìn)的動(dòng)物進(jìn)行監(jiān)測(cè)或作檢疫監(jiān)測(cè)。第三是對(duì)將用于鼠的生物材料進(jìn)行監(jiān)測(cè)。單位一般都有一個(gè)實(shí)驗(yàn)鼠的健康準(zhǔn)入標(biāo)準(zhǔn)，即供應(yīng)商所提供的健康報(bào)告應(yīng)該包括必檢的項(xiàng)目和不能有特定病原的存在。

新引進(jìn)動(dòng)物的監(jiān)測(cè)：?jiǎn)挝豢梢远嘤嗁?gòu)一定數(shù)量的鼠，在接收后立即安樂(lè)死進(jìn)行檢測(cè)或送到第三方實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，以便核實(shí)供應(yīng)商的健康報(bào)告，減少污染設(shè)施的風(fēng)險(xiǎn)。需要注意的是，該做法必須通過(guò)單位的倫理審查委員會(huì)的審核批準(zhǔn)才能實(shí)施?，F(xiàn)在的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)商一般都有較完備的健康監(jiān)測(cè)計(jì)劃，一般都可提供不同的屏障或房間的健康報(bào)告。一般可以通過(guò)嚴(yán)格評(píng)估選定一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)商，開(kāi)始合作時(shí)可能需要核實(shí)其健康報(bào)告，但良好的互信的合作關(guān)系建立后可不執(zhí)行此計(jì)劃或抽檢即可。如果動(dòng)物來(lái)自科研院所則情況有所不同，其健康監(jiān)測(cè)計(jì)劃各不相同，所以以防萬(wàn)一可以采用此方法進(jìn)行核實(shí)。

檢疫期監(jiān)測(cè)：絕大多數(shù)情況下，來(lái)自高品質(zhì)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)商的、用有高效濾膜的運(yùn)輸盒運(yùn)輸?shù)?、且運(yùn)抵時(shí)運(yùn)輸盒完整的實(shí)驗(yàn)鼠對(duì)設(shè)施里的動(dòng)物造成污染的風(fēng)險(xiǎn)很低，一般不需要隔離而可直接運(yùn)至設(shè)施內(nèi)的動(dòng)物房。在這種情況下，接收時(shí)應(yīng)該仔細(xì)檢查運(yùn)輸盒是否完整、拒收運(yùn)輸盒有破損的動(dòng)物、細(xì)心地拿放運(yùn)輸盒并對(duì)其表面進(jìn)行消毒，以減少其表面污染對(duì)設(shè)施所造成的危害。對(duì)于其他來(lái)源的實(shí)驗(yàn)鼠，一般其生產(chǎn)質(zhì)量控制、裝運(yùn)等都不太嚴(yán)格，執(zhí)行適宜的檢疫可能很重要。這些動(dòng)物可能多為特殊的模型/基因工程小鼠，因此其提供方的健康監(jiān)測(cè)計(jì)劃可能是針對(duì)這些特定的動(dòng)物的，可能不能完全符合接收設(shè)施的健康監(jiān)測(cè)規(guī)程。而且這些動(dòng)物多為“稀缺”動(dòng)物，所以對(duì)其接收和接收后的檢疫工作等應(yīng)該進(jìn)行精心準(zhǔn)備。檢疫期通過(guò)前應(yīng)該視它們?yōu)榭梢傻母腥驹矗虼藨?yīng)該遵循檢疫期的相關(guān)操作規(guī)程。檢疫期的動(dòng)物和別的動(dòng)物應(yīng)該隔離開(kāi)，最好是房間水平的隔離，但如果空間有限可使用隔離器等設(shè)備。另外，如果對(duì)動(dòng)物供應(yīng)商的品質(zhì)不懷疑，但對(duì)動(dòng)物的運(yùn)輸有疑慮，可對(duì)動(dòng)物進(jìn)行監(jiān)測(cè)以排除運(yùn)輸過(guò)程中的污染。如果使用血清學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)，則不能在接收時(shí)立即安樂(lè)死動(dòng)物監(jiān)測(cè)，可將其置于檢疫期一定時(shí)間后再監(jiān)測(cè)。因?yàn)閯?dòng)物如果在運(yùn)輸過(guò)程中感染/污染，至少需要大約一周的時(shí)間才能產(chǎn)生抗體。也可在到達(dá)后第3天，從每只鼠采集糞便樣本（注意盡量“無(wú)菌”操作），每10個(gè)動(dòng)物的樣本混合后可采用PCR的方法檢測(cè)常見(jiàn)的腸道病原。或者從每一動(dòng)物采集糞樣、口腔拭子或鼻/肺沖洗物、和無(wú)毛動(dòng)物的皮膚拭子，10只動(dòng)物的樣本按不同的類(lèi)型分別混合，進(jìn)行鼠常見(jiàn)傳染病原的PCR檢測(cè)。也可采糞樣、肛周膠帶粘貼取樣、毛發(fā)等進(jìn)行寄生蟲(chóng)的檢測(cè)。

生物材料的監(jiān)測(cè)：生物材料如細(xì)胞培養(yǎng)物和腫瘤組織/細(xì)胞等的微生物污染可危及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施的生物安全以及對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究造成負(fù)面影響。所有的生物材料在接種實(shí)驗(yàn)鼠之前都應(yīng)該進(jìn)行檢測(cè)以確定沒(méi)有外源性微生物（主要是鼠的一些傳染病病原體）污染?？赏ㄟ^(guò)將生物材料接種鼠，4～6周后檢測(cè)是否有相關(guān)抗體產(chǎn)生?，F(xiàn)多用PCR的方法檢測(cè)。

直接從種群中隨機(jī)抽取動(dòng)物進(jìn)行監(jiān)測(cè)：嚙齒類(lèi)動(dòng)物體型小、能采集的血樣少，所以不可能用大動(dòng)物（如豬、犬、猴等）的疾病監(jiān)測(cè)方法諸如采血樣檢測(cè)等來(lái)進(jìn)行動(dòng)物群體健康監(jiān)測(cè)。一般的鼠群的健康監(jiān)測(cè)都得安樂(lè)死動(dòng)物并采集足夠的血樣和組織樣品?？芍苯与S機(jī)從動(dòng)物群中選取動(dòng)物作為群體的代表來(lái)檢測(cè)。用這種監(jiān)測(cè)模式不需要在種群中引入哨兵鼠，因此可以避免通過(guò)哨兵鼠而引入感染。另外的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)時(shí)在需要進(jìn)行監(jiān)測(cè)時(shí)，一般可立即從種群中選取所需要數(shù)目的鼠進(jìn)行采樣，而使用哨兵鼠時(shí)則需要把哨兵鼠置于種群中一定的時(shí)間以確保其獲得機(jī)會(huì)來(lái)暴露給種群中存在的病原并產(chǎn)生感染。直接抽取動(dòng)物檢測(cè)的前提是選取的動(dòng)物已經(jīng)盡可能地暴露給了存在于種群中的病原微生物。例如可以使用開(kāi)放性籠蓋的鼠籠、甚或采用與哨兵鼠相似的“臟墊料”法，即轉(zhuǎn)移最可能有感染的墊料至預(yù)先選定的鼠籠。如果使用血清學(xué)方法監(jiān)測(cè)，則選取的動(dòng)物必須能產(chǎn)生抗體。因?yàn)榛蚬こ淌蟮拿庖邔W(xué)狀況未知或很難確定，所以選取基因工程鼠進(jìn)行監(jiān)測(cè)時(shí)有很多的不確定因素，即這些動(dòng)物能否產(chǎn)生有效的抗體水平。如果某些動(dòng)物有免疫缺陷，則不適于血清學(xué)檢測(cè)（可造成假陰性結(jié)果），但如果運(yùn)用得當(dāng)，采用直接檢測(cè)病原的方法如PCR、細(xì)菌學(xué)和寄生蟲(chóng)學(xué)，則也能很好地應(yīng)用免疫缺陷動(dòng)物來(lái)進(jìn)行動(dòng)物種群的健康監(jiān)測(cè)，因?yàn)檫@些免疫缺陷的動(dòng)物對(duì)寄生蟲(chóng)和細(xì)菌的抵抗力較弱，一般可長(zhǎng)時(shí)間的乃至終生的保持活動(dòng)性感染。選取動(dòng)物時(shí)應(yīng)該在一個(gè)動(dòng)物房?jī)?nèi)多點(diǎn)取樣，以盡可能的監(jiān)測(cè)出僅在局部分布（如某個(gè)籠架）的感染，這也因房間通風(fēng)方式以及使用的籠具體系等的不同而異。如果一個(gè)動(dòng)物房?jī)?nèi)有不同的品系或封閉群的動(dòng)物，則應(yīng)該各選取其代表動(dòng)物進(jìn)行監(jiān)測(cè)。在動(dòng)物年齡的選擇上，應(yīng)該盡量選取年幼的和老的動(dòng)物，但要避免使用年齡過(guò)大的動(dòng)物，因?yàn)榧纳x(chóng)多寄生于年幼鼠，而年老的鼠則有最大的可能暴露給設(shè)施內(nèi)的微生物從而產(chǎn)生血清陽(yáng)轉(zhuǎn)。但是年老的特別是無(wú)免疫缺陷的鼠可能對(duì)感染其的病原產(chǎn)生了免疫反應(yīng)進(jìn)而部分或全部地把大多數(shù)的寄生蟲(chóng)或病毒等都清除了，所以這些鼠用直接檢測(cè)病原的方法來(lái)檢測(cè)的話很可能會(huì)是陰性的。太小的鼠因?yàn)槠淠冈纯贵w的存在可能也會(huì)影響到血清學(xué)的檢測(cè)。對(duì)于繁殖種群而言，最好的是選取因年老而淘汰的種鼠和過(guò)剩的斷奶鼠。例如，選擇4～5周齡的鼠檢測(cè)腸道原蟲(chóng)最好、8～10周齡檢測(cè)蟯蟲(chóng)最好、10～12周齡監(jiān)測(cè)卡氏肺孢子蟲(chóng)最好，但是超過(guò)幾月齡的鼠則對(duì)細(xì)小病毒不易感。健康監(jiān)測(cè)的目的是準(zhǔn)確地檢測(cè)出在一個(gè)種群中是否有某（些）病原體的存在（即在某種群中至少有一例陽(yáng)性），而不是準(zhǔn)確地確定感染或疾病的流行率（即多少動(dòng)物感染了）。理論上講，樣本的量是依賴(lài)于種群中的病原的流行率的。運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)的原理和公式，有不同的作者或機(jī)構(gòu)制定了樣本大小的指南，如可用log（1-置信度）/log（1-預(yù)期的流行率）來(lái)計(jì)算樣本大小。例如，一個(gè)鼠群某病原的流行率估計(jì)為30％，置信度為95％時(shí)，則樣本量為8～10；若流行率為10％，則需要25～30個(gè)樣本。另外可參考現(xiàn)行的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)》國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。顯而易見(jiàn)，對(duì)于流行率低的病原，如果使用獨(dú)立通風(fēng)籠具則使病原傳播率更低，因此需要采集的樣本數(shù)量很大，所以大多設(shè)施采用哨兵鼠來(lái)進(jìn)行健康監(jiān)測(cè)。

使用哨兵鼠進(jìn)行鼠群健康檢測(cè)：現(xiàn)在的實(shí)驗(yàn)鼠設(shè)施多使用小隔離器、層流架、獨(dú)立通風(fēng)籠具等使得疾病傳播率很低（流行率多低于30％）而且流行或分布不均一。另外從動(dòng)物群中抽取動(dòng)物要做到真正隨機(jī)的話則不影響到科研究很難。這些都使得隨機(jī)抽取動(dòng)物進(jìn)行健康監(jiān)測(cè)的方法不太適用?？梢栽谑笕褐蟹胖蒙诒?，盡可能地讓這些鼠暴露給動(dòng)物設(shè)施中的微生物，然后通過(guò)檢測(cè)這些鼠來(lái)反推出種群的健康狀況或者其微生物感染狀況?？蓮纳诒蟛裳?、取樣、甚至安樂(lè)死來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，而不干擾在研的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。原則上哨兵動(dòng)物應(yīng)該是免疫健全的年輕成年鼠（多為6～8周），多在3～5周齡時(shí)引入并在種群中放置足夠長(zhǎng)的時(shí)間以讓這些哨兵鼠充分地暴露給種群中和/或動(dòng)物房間中的病原，一般為至少4～6周，以便檢測(cè)抗體和寄生蟲(chóng)。也應(yīng)避免使用太老的動(dòng)物作為哨兵鼠，因?yàn)榭赡軐?dǎo)致血清學(xué)假陰性。哨兵鼠的品系/封閉群的選擇也要慎重。使用和所要檢測(cè)的種群相同品系的動(dòng)物較好如可以多購(gòu)買(mǎi)幾只作為哨兵鼠使用，因?yàn)檫@樣可以避免因哨兵鼠而引入感染的風(fēng)險(xiǎn)。但也要考慮到所要檢測(cè)動(dòng)物的免疫學(xué)狀況，如免疫有缺陷的動(dòng)物就不適用這一方法。一般選用封閉群的鼠作為哨兵鼠，如CD小鼠和SD大鼠，因?yàn)樗鼈儗?duì)病原易感但不發(fā)病、能產(chǎn)生很好的免疫學(xué)應(yīng)答，而且價(jià)格不貴。有些近交系的鼠對(duì)有些病原部分或完全不易感，因此應(yīng)該酌情避免使用，例如C57BL/6對(duì)小鼠細(xì)小病毒MPV不易感、SJL對(duì)小鼠肝炎病毒的呼吸道株（多器官親嗜性）不易感等。還有DBA/2小鼠的抗體應(yīng)答緩慢，也應(yīng)避免使用。引入哨兵鼠的風(fēng)險(xiǎn)也有很多。例如，要考慮到由哨兵鼠本身的感染而污染/感染其它動(dòng)物的可能性。但這種風(fēng)險(xiǎn)可以通過(guò)對(duì)哨兵鼠來(lái)源的慎重選擇而降低，例如可從高品質(zhì)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)商購(gòu)買(mǎi)動(dòng)物作為哨兵鼠（并確定沒(méi)有針對(duì)要檢測(cè)的病原的抗體）。也可以在將哨兵鼠引入種群之前對(duì)新購(gòu)進(jìn)哨兵鼠進(jìn)行適宜的隔離檢疫，以弄清其微生物狀況?？梢允褂迷O(shè)施里生產(chǎn)的鼠，但一般不提倡，因?yàn)檫@樣會(huì)涉及到很多額外的生物安全問(wèn)題。有種做法是盡量只使用來(lái)源自隔離器中飼養(yǎng)的微生物學(xué)狀況清楚的動(dòng)物，如可使用無(wú)免疫缺陷的雜合子的裸鼠來(lái)作為哨兵鼠。

哨兵鼠都是以間接的方式來(lái)暴露給病原，如通過(guò)采集種群中其它鼠使用過(guò)的墊料即臟墊料，特別是疑似感染的動(dòng)物的臟墊料，放置到哨兵鼠籠。這種方法是標(biāo)準(zhǔn)的方法，適用于獨(dú)立通風(fēng)籠具飼養(yǎng)的鼠、免疫缺陷鼠等的健康監(jiān)測(cè)。但也可使用直接接觸法來(lái)感染哨兵鼠，即將哨兵鼠和種群中其它的鼠合養(yǎng)（也就是直接接觸），多適用于檢疫期，這樣做的風(fēng)險(xiǎn)在于哨兵鼠可感染其它的鼠或造成遺傳學(xué)污染或打斗，而且很難采集很多籠的鼠進(jìn)行檢測(cè)。這種情況下，可選用毛色上和種群中的其它動(dòng)物不同的哨兵鼠。臟墊料法也存在諸多缺陷，例如纖毛相關(guān)呼吸道桿菌和乳酸脫氫酶增高癥病毒就不通過(guò)臟墊料傳播，仙臺(tái)病毒和螺旋桿菌則不能很好地通過(guò)墊料傳播。通常的做法是在每次換墊料時(shí)，盡可能多的把種群中動(dòng)物的臟墊料（每籠取5～15mL）轉(zhuǎn)到哨兵鼠籠。一般不添加新的墊料，因?yàn)樾碌膲|料會(huì)稀釋臟墊料中可能含有的病原，使其達(dá)不到最低感染劑量。一個(gè)折中的辦法是，如果使用筑巢材料作為一種豐富環(huán)境的措施，則可放置新的筑巢材料于哨兵鼠籠。動(dòng)物排毒會(huì)隨著病毒感染過(guò)程的推進(jìn)而減弱直至感染結(jié)束。采樣作血清學(xué)檢測(cè)的時(shí)間和哨兵鼠最后接觸臟墊料的時(shí)間應(yīng)該間隔2～3周（3～4周可能更好），因?yàn)閷?duì)于大多的病原來(lái)說(shuō)，哨兵鼠需要7～14d的時(shí)間來(lái)產(chǎn)生抗體。但是針對(duì)鼠諾瓦克病毒的血清陽(yáng)轉(zhuǎn)則可能需要8周的時(shí)間。然而，哨兵鼠放置在種群中的時(shí)間不宜超過(guò)3個(gè)月，主要是因?yàn)槭髮?duì)小鼠細(xì)小病毒這個(gè)小鼠最常見(jiàn)的病毒的易感性隨年齡增長(zhǎng)而下降。

哨兵鼠和其所“代表”的種群動(dòng)物的比例也要適當(dāng)，但是沒(méi)有相關(guān)的正式指南。如1個(gè)有2～3只哨兵鼠的籠子可用來(lái)檢測(cè)50～80籠的動(dòng)物。依據(jù)所希望保持的微生物學(xué)狀態(tài)、飼養(yǎng)方式、籠具系統(tǒng)等的不同，這個(gè)比例會(huì)有不同。大多獨(dú)立通風(fēng)籠具在籠架的每側(cè)都放置一哨兵鼠籠。應(yīng)該平衡一下風(fēng)險(xiǎn)和費(fèi)用的關(guān)系。例如，如果1個(gè)哨兵鼠籠代表50～80籠鼠，如果哨兵鼠檢測(cè)陽(yáng)性，為找出是哪籠鼠除了問(wèn)題則可能需要對(duì)50～80個(gè)籠的動(dòng)物分別檢測(cè)。如果同樣的50～80籠鼠，設(shè)置兩籠哨兵鼠，如果其中一籠檢測(cè)陽(yáng)性，則只需要檢測(cè)其所代表的那25～40籠鼠。一般每季度采樣檢測(cè)，這種安排最適于血清學(xué)檢測(cè)。因同年齡的鼠放在一個(gè)籠子里，其微生物狀態(tài)會(huì)大致一致，所以不用對(duì)哨兵鼠籠的所有動(dòng)物都進(jìn)行檢測(cè)，一般每籠檢測(cè)一只。在樣本（哨兵鼠和/或血清等）送檢后，即可引入新的哨兵鼠，這些新的動(dòng)物可以去接觸已有的感染并作為橋梁來(lái)承上啟下即對(duì)那些上批哨兵鼠尚未發(fā)生血清陽(yáng)轉(zhuǎn)的病原產(chǎn)生免疫應(yīng)答。當(dāng)結(jié)果出來(lái)時(shí)，可對(duì)“老”的哨兵鼠實(shí)施安樂(lè)死，一來(lái)可以去驗(yàn)證那些陽(yáng)性結(jié)果，二來(lái)可以采樣用于檢測(cè)其它感興趣的但尚未檢測(cè)的病原（即未列在上次檢測(cè)計(jì)劃中的病原等）。因?yàn)榭赡懿皇撬械纳诒蠖紩?huì)對(duì)小鼠細(xì)小病毒發(fā)生血清陽(yáng)轉(zhuǎn)，所以要注意的是如每籠哨兵鼠只檢測(cè)一只可能會(huì)降低微生物監(jiān)測(cè)的靈敏度，但這樣做可省錢(qián)，或者對(duì)剩余的哨兵鼠只進(jìn)行細(xì)小病毒檢測(cè)。

哨兵鼠籠的放置位置應(yīng)考慮盡量增大這些動(dòng)物的感染機(jī)會(huì)。如和種群中的動(dòng)物接近、放在籠架底層、離出風(fēng)口近等。另外可固定在某些位置，這樣能引起飼養(yǎng)人員和科研人員的注意。哨兵鼠多為雌性，一來(lái)可減少動(dòng)物的打斗，二來(lái)可避免對(duì)種群因計(jì)劃外的交配而造成遺傳學(xué)污染。

哨兵鼠計(jì)劃有以下內(nèi)在的缺陷：一是對(duì)微生物的檢測(cè)是間接的（即不是對(duì)種群中的動(dòng)物直接檢測(cè)）而且有時(shí)間上的滯后。制約因素有哨兵鼠必須易感、種群中的動(dòng)物是否處在排毒的活動(dòng)期、某些病原在環(huán)境中易滅活（所以要使用新鮮臟墊料）、哨兵鼠能否暴露給足夠量的病原（臟墊料的量要夠而且要混合均勻）、哨兵鼠必須血清陽(yáng)轉(zhuǎn)或開(kāi)始排毒（滯后1～8周）等。二是如果哨兵鼠檢測(cè)為陽(yáng)性，則不易判斷其感染的來(lái)源。感染可能源自哨兵鼠本身、哨兵鼠經(jīng)由其它意外的途徑（如飲水、飼料、試驗(yàn)處理、籠具清洗等）而感染，而且感染可能來(lái)自任何一個(gè)該哨兵鼠所代表的鼠籠。

3 實(shí)驗(yàn)鼠群健康監(jiān)測(cè)的方法

實(shí)驗(yàn)鼠群健康檢測(cè)所涉及的方法學(xué)有很多，如剖檢前的檢查（如環(huán)境檢測(cè)數(shù)據(jù)、飼養(yǎng)管理情形、種群的大小、動(dòng)物品種、遺傳學(xué)背景、免疫學(xué)狀況、動(dòng)物標(biāo)識(shí)等）、大體剖檢、血清學(xué)、細(xì)菌培養(yǎng)、分子生物學(xué)診斷技術(shù)如PCR、寄生蟲(chóng)學(xué)檢查、組織病理學(xué)、和其它的一些診斷方法。最常用的還是血清學(xué)和PCR。詳盡的方法學(xué)恕不詳述。要注意的是對(duì)樣本及樣本的處理過(guò)程進(jìn)行適宜的質(zhì)控、以及陰、陽(yáng)性對(duì)照的合理使用。

4 實(shí)驗(yàn)鼠群健康監(jiān)測(cè)的樣本采集原則

因擬定使用的檢測(cè)方法的不同和/或檢測(cè)的病原的不同采集的樣本也有所不同。如采用血清學(xué)方法，則要采集血液分離血清。血清可用PBS進(jìn)行適度稀釋?zhuān)?份血清加入4份PBS。如對(duì)生物安全3級(jí)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的鼠進(jìn)行健康檢測(cè)，則血清應(yīng)該進(jìn)行滅活如加熱滅活。另外，對(duì)生物安全3級(jí)實(shí)驗(yàn)室，可使用經(jīng)福爾馬林固定的組織/糞便樣品等來(lái)進(jìn)行PCR檢測(cè)、寄生蟲(chóng)檢測(cè)和組織病理學(xué)檢測(cè)。

合并樣品（把不同動(dòng)物的樣品混合在一起作為一個(gè)樣品檢測(cè)）可減少需要檢測(cè)的樣本數(shù)量，從而可以減少費(fèi)用。但是需要滿(mǎn)足以下兩個(gè)條件。一是檢測(cè)的方法要足夠靈敏（即可檢測(cè)出僅存在于混合樣品中的某一樣品中的微量微生物或其成分），一般適用于PCR和寄生蟲(chóng)糞檢，不適用于血清學(xué)。二是在經(jīng)濟(jì)上要合理，即假設(shè)要混合X個(gè)樣品成一個(gè)混合樣，只有少于（X-1）/X的混合后樣品為陽(yáng)性時(shí)，在經(jīng)濟(jì)上才是合理的。例如有100個(gè)樣品，10個(gè)混為一個(gè)（即上述公式中的X），即有10個(gè)混合樣。如果混合樣一旦為陽(yáng)性，則可能需要檢測(cè)其混合前的每一樣品。按照這樣的推理，如果有（10-1）/10即10個(gè)混合樣中有9個(gè)為陽(yáng)性，則總共的檢測(cè)次數(shù)為100，和不混合樣品一樣。如果10個(gè)樣中有8個(gè)為陽(yáng)性，則總共的檢測(cè)次數(shù)為90，比較經(jīng)濟(jì)。

最好是和檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室聯(lián)系，咨詢(xún)?nèi)绾稳蛹皹悠诽幚淼葐?wèn)題。運(yùn)送活體動(dòng)物和相關(guān)樣本應(yīng)該按照國(guó)際國(guó)內(nèi)的相關(guān)法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)來(lái)進(jìn)行。

另外，如果鼠群中有動(dòng)物死亡，也可多剖檢和診斷，這可以作為常規(guī)健康檢測(cè)計(jì)劃的一個(gè)很有益的補(bǔ)充甚至組成部分。

5 實(shí)驗(yàn)鼠種群健康檢測(cè)結(jié)果的解讀及應(yīng)對(duì)措施

應(yīng)該由負(fù)責(zé)該動(dòng)物種群健康的相關(guān)專(zhuān)家來(lái)解讀健康檢測(cè)結(jié)果，看是否有異常的或意外的結(jié)果。如果沒(méi)有異常結(jié)果，可以按照相關(guān)要求對(duì)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)管理或?qū)?bào)告進(jìn)行歸檔。如果檢出陽(yáng)性，建議在采取措施之前，聯(lián)系診斷實(shí)驗(yàn)室，確定陽(yáng)性結(jié)果以及其可能的意義，然后啟動(dòng)相應(yīng)的應(yīng)對(duì)措施。診斷實(shí)驗(yàn)室可以給出他們對(duì)陽(yáng)性結(jié)果的看法，如屬?gòu)?qiáng)陽(yáng)性還是弱陽(yáng)性、是否某檢測(cè)方法常有假陽(yáng)性結(jié)果、或者說(shuō)某病原很少見(jiàn)所以其檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的意義不大等。另外診斷實(shí)驗(yàn)室還可就如何最快最好確證陽(yáng)性結(jié)果提供建議。在對(duì)某陽(yáng)性結(jié)果采取措施之前，要將檢測(cè)結(jié)果知會(huì)單位內(nèi)部的動(dòng)物倫理審查委員會(huì)和其他相關(guān)的部門(mén)和人員。單位要及時(shí)地對(duì)健康檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行匯總和分析，進(jìn)而可以對(duì)監(jiān)測(cè)計(jì)劃進(jìn)行修訂，如增/減檢測(cè)的病原、對(duì)個(gè)別病原增/建檢測(cè)頻率、采用新的檢測(cè)方法等。

總之，沒(méi)有一成不變的健康監(jiān)測(cè)計(jì)劃，也沒(méi)有一個(gè)放諸四海而皆準(zhǔn)的健康監(jiān)測(cè)規(guī)程。讀者在了解上述的一些有關(guān)實(shí)驗(yàn)鼠群健康監(jiān)測(cè)的基本原理之后，在制訂監(jiān)測(cè)計(jì)劃時(shí)，可參考前文有關(guān)“如何建立實(shí)驗(yàn)鼠群健康監(jiān)測(cè)規(guī)程”一節(jié)的內(nèi)容，充分用好互聯(lián)網(wǎng)等資源，對(duì)國(guó)內(nèi)外一些著名大學(xué)、科研機(jī)構(gòu)的相關(guān)資料進(jìn)行仔細(xì)研究和推敲，結(jié)合我國(guó)的實(shí)情，建立并在實(shí)踐中逐步完善富有單位特色但確實(shí)行之有效的實(shí)驗(yàn)鼠群健康管理體系。

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