蔣朝暉，呂玉晶，趙 芳，朱麗英，楊國珍，潘 衛(wèi)

（貴陽醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，貴陽 550004）

高脂高糖飲食結(jié)合小劑量的STZ是建立2型糖尿病動(dòng)物模型的常用方法，該造模方法具有方法簡單、成本低廉、模型穩(wěn)定以及與人類2型糖尿病臨床特征較為吻合等優(yōu)點(diǎn)?，F(xiàn)有研究報(bào)告多選用成年大鼠建模［1，2］，由于建模需時(shí)較長，模型大鼠容易進(jìn)入老年期，生存質(zhì)量下降沒有充分的時(shí)間保證糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。本研究在參考前人的研究基礎(chǔ)上，利用SD幼鼠建立2型糖尿病及其并發(fā)癥模型，并摸索了STZ的用量和取血方式等，對(duì)建模方法進(jìn)行了改良。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物分組及喂養(yǎng)

健康清潔級(jí)4周齡SD雄性幼鼠40只，由貴陽醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供［SCXK（黔）2002-0001］。測(cè)定每只大鼠的空腹血糖，血糖正常者進(jìn)入實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組20只。每籠為同組的大鼠5只，自由攝食飲水，自然光照。

1.2 試劑與飼料

STZ（美國Sigma公司），胰島素測(cè)定試劑盒（北京北方生物技術(shù)研究所），血糖儀、血糖試紙（美國雅培公司），甘油三酯、膽固醇、ALT、AST檢測(cè)試劑盒（四川邁克公司）等。普通飼料：碳水化合物60％、蛋白質(zhì)22％、脂肪10％、其他8％。高脂高糖飼料：動(dòng)物脂肪15％、蔗糖20％、膽固醇5％、普通飼料60％，飼料由貴陽醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心加工。

1.3 SD幼鼠胰島素抵抗的誘導(dǎo)

對(duì)照組喂以普通飼料，實(shí)驗(yàn)組喂以高脂高糖飼料，每15天監(jiān)測(cè)一次體重，4個(gè)月后尾動(dòng)脈取血，檢測(cè)空腹血糖、空腹胰島素、甘油三酯和膽固醇，以胰島素作用指數(shù)（Insulin action index，IAI）評(píng)價(jià)其胰島素抵抗程度，IAI=ln［1/（空腹胰島素×空腹血糖）］，IAI＜對(duì)照組即為誘導(dǎo)胰島素抵抗成功［3］。

1.4 STZ致糖尿病亞致病劑量的確定

另外選取成年健康SD雄性大鼠25只，適應(yīng)環(huán)境1周。將25只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、D20、D30、D40、D50組，禁食12h后，對(duì)照組腹腔注射枸櫞酸緩沖液，D20、D30、D40、D50組分別按20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg的劑量腹腔注射STZ溶液，72h后尾部取血測(cè)定空腹血糖。選擇能使血糖升高但低于糖尿病標(biāo)準(zhǔn)（本研究確定為介于4.61mmol/L～7.1mmol/L之間）的劑量為STZ亞致病劑量。

1.5 2型糖尿病大鼠模型的建立

胰島素抵抗誘導(dǎo)成功后，實(shí)驗(yàn)組大鼠空腹腹腔注射亞致病劑量的STZ（以pH4.4，0.01mmol/L枸櫞酸緩沖液配成20g/L濃度），對(duì)照組僅注射相同體積枸櫞酸緩沖液。注射STZ72h后，空腹血糖＞7.0mmol/L、隔天隨機(jī)血糖＞11.1mmol/L者即為2型糖尿病大鼠模型。每周通過尿試紙檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組尿糖，間接觀察其血糖的變化趨勢(shì)。

1.6 2型糖尿病并發(fā)癥的觀察

繼續(xù)高脂高糖飲食喂養(yǎng)2型糖尿病大鼠使病程發(fā)展，逐月分批眼球摘除放血處死大鼠，檢測(cè)其生化指標(biāo)并結(jié)合臟器的病理變化來評(píng)價(jià)糖尿病并發(fā)癥的發(fā)展。

1.7 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 高脂高糖飲食對(duì)大鼠的影響

與對(duì)照組大鼠比較，高脂高糖組大鼠經(jīng)喂養(yǎng)4個(gè)月后，體重明顯增加，血糖升高，血清胰島素水平升高，實(shí)驗(yàn)組IAI＜對(duì)照組，血脂紊亂（表1），以上指標(biāo)說明高脂高糖飲食誘導(dǎo)大鼠胰島素抵抗成功。

表1 4個(gè)月時(shí)高脂高糖組與對(duì)照組大鼠基本特征比較Tab.1 Basic characteristics of rats with high-fat/high-sucrose and healthy controls at 4 months

2.2 STZ致糖尿病亞致病劑量

腹腔注射STZ后，D20、D30、D40、D50各組大鼠空腹血糖均有不同程度的升高（圖1），其中30mg/kg大鼠體重的劑量能導(dǎo)致空腹血糖升高（6.27±0.17mmol/L），但低于致糖尿病的標(biāo)準(zhǔn)（7.0mmol/L），確定為STZ亞致病劑量。

2.3 2型糖尿病大鼠成模情況

實(shí)驗(yàn)組20只大鼠在高脂高糖喂養(yǎng)過程中，體重增長速度快于對(duì)照組，4個(gè)月后100％出現(xiàn)胰島素抵抗，注射30mg/kg劑量的STZ后，實(shí)驗(yàn)組20只大鼠血糖明顯升高，其均值為13.7±1.57mmol/L，大鼠出現(xiàn)緩慢的消瘦、飲食大幅增多，24h尿量明顯增多，部分大鼠出現(xiàn)爛尾現(xiàn)象，具有糖尿病典型的“三多一少”臨床表現(xiàn)，說明2型糖尿病大鼠模型建立成功。成模后，其尿糖水平一直保持在“+++ ～++++”，說明模型穩(wěn)定性較好。

圖1 不同劑量STZ組大鼠血糖水平Fig.1 Blood glucose levels in different dose of STZ

2.4 2型糖尿病大鼠部分臟器的病變情況

在2型糖尿病大鼠成模3個(gè)月后，大鼠的胰腺、肝臟、腎臟、脾臟和腦組織等多個(gè)器官發(fā)生病變。現(xiàn)以肝臟為代表進(jìn)行報(bào)道。

與正常對(duì)照組比較，2型糖尿病組大鼠肝臟體積增大，出現(xiàn)明顯的脂肪肝病變（圖2）。HE染色顯示肝細(xì)胞明顯空泡變性（圖中箭頭所示）、可見點(diǎn)狀壞死，匯管區(qū)有炎細(xì)胞浸潤（圖3）。（圖見彩插1）

3 討論

胰島素抵抗與胰島功能受損是2型糖尿病的發(fā)病機(jī)理中不可缺少的兩個(gè)重要因素，并且胰島素抵抗是2型糖尿病的始動(dòng)因素［4］，而長期高脂高糖量飲食喂養(yǎng)能誘導(dǎo)大鼠能產(chǎn)生胰島素抵抗［5］。在此基礎(chǔ)上，我們采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)SD幼鼠形成胰島素抵抗，再給予亞致病劑量的的STZ建立2型糖尿病模型，繼續(xù)高脂高糖喂養(yǎng)，使其血糖維持在高水平，形成2型糖尿病并多種并發(fā)癥。通過對(duì)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠的多個(gè)生化指標(biāo)以及臟器病理變化的觀察，表明本研究成功建立了2型糖尿病及其并發(fā)癥模型。

采取幼鼠造模的優(yōu)勢(shì)：由于形成胰島素抵抗的時(shí)間需要4個(gè)月，成年大鼠經(jīng)過4個(gè)月的飼養(yǎng)后，有可能進(jìn)入老齡期，老齡化會(huì)導(dǎo)致胰腺功能減退、空腹血糖、胰島素升高［6］。采用一個(gè)月的幼鼠造模，此時(shí)實(shí)驗(yàn)大鼠年齡為5個(gè)月，處于成年期，成年大鼠對(duì)于STZ造成胰腺損傷修復(fù)功能較強(qiáng)，能保持血糖水平不至于太高，延長了模型大鼠的生存時(shí)間，有充分的時(shí)間保證2型糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。在建模過程中，經(jīng)高脂高糖飲食喂養(yǎng)4個(gè)月后，大鼠還具有典型的腹部肥胖、血脂紊亂、血壓升高等代謝綜合征的特點(diǎn)［7］，可用于代謝綜合征發(fā)病機(jī)制和脂毒性等相關(guān)研究。同時(shí)，流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病及其并發(fā)癥在肥胖兒童人群中發(fā)病率呈上升趨勢(shì)［8-10］，采用幼鼠造模符合這一特點(diǎn)，能為肥胖兒童糖尿病研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

STZ亞致病劑量的確定：STZ能特異性殺傷胰島β細(xì)胞是誘發(fā)糖尿病的機(jī)制，目前對(duì)于STZ的用量和用法均有不同的觀點(diǎn)。多數(shù)研究都是參考他人報(bào)道劑量，由于大鼠的個(gè)體差異而存在一定的缺陷。本研究通過實(shí)驗(yàn)，觀察不同劑量STZ對(duì)大鼠血糖的影響，確定了本研究的用量，這是對(duì)該類建模方法的有益補(bǔ)充。

在建模方法上，本研究還摸索了大鼠取血方式：對(duì)于少量的用血（1mL以下），如用血糖儀測(cè)血糖時(shí)，可用針刺尾靜脈或斷尾取血；自體前后對(duì)照和長期間斷取血，用血量大（1mL以上），但又不能危害大鼠生命時(shí)，如檢測(cè)大鼠血脂、肝功能時(shí)，可從尾動(dòng)脈用注射器取血；需大量用血（5～10mL）且不需顧及大鼠生命時(shí)，可以摘眼球取血。通過上述方法采取的血液具有無污染、不溶血的特點(diǎn)，能滿足不同的實(shí)驗(yàn)需要。

2型糖尿病大鼠模型的判斷標(biāo)準(zhǔn)有待商榷：目前對(duì)于2型糖尿病模型診斷標(biāo)準(zhǔn)目前尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)［11］，主要是空腹血糖結(jié)合胰島素抵抗來判定。由于造模方法和模型遺傳背景的差異，血糖升高標(biāo)準(zhǔn)也各不相同，從7.8mmol/L～16.8mmol/L均有報(bào)道［1，2］。由于大鼠采血困難，本研究采用空腹血糖和空腹胰島素來評(píng)價(jià)2型糖尿病，血糖水平采用的是ADA90制定的人類2型糖尿病的判斷標(biāo)準(zhǔn)，略低于報(bào)道水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明模型大鼠血糖水平為13.8±2.2mmol/L，如何確定一個(gè)合理的血糖升高范圍有待進(jìn)一步研究。

總之，本研究在借鑒前人研究的基礎(chǔ)上，對(duì)建立2型糖尿病及其并發(fā)癥大鼠模型進(jìn)行了改良，摸索了建立類似模型的一些實(shí)驗(yàn)方法，為2型糖尿病，特別是肥胖青少年2型糖尿病及其并發(fā)癥的研究打下了基礎(chǔ)。

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