李明岳，鮑世韻，劉嘉林，鄭錦鋒，林寶行，余小舫

（暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)深圳市人民院，深圳 518020）

組蛋白在翻譯后的修飾中會(huì)發(fā)生改變，從而提供一種識(shí)別的標(biāo)志，為其它蛋白與DNA的結(jié)合產(chǎn)生協(xié)同或拮抗效應(yīng)，是一種動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)錄調(diào)控成分［1］。染色質(zhì)免疫共沉淀-實(shí)時(shí)定量PCR法（chromatin immunoprecipitation-real time quantitative PCR methods，CHIP-PCR）技術(shù)可以檢測(cè)特定DNA序列染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)，能夠充分反映生理?xiàng)l件下的DNA與蛋白質(zhì)相互作用的真實(shí)情況［2］。MafA基因又稱(chēng)亮氨酸拉鏈蛋白Maf家族A（v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene family protein A，MafA），是一個(gè)關(guān)鍵的基因特異性表達(dá)的調(diào)節(jié)器，對(duì)于胰腺生長(zhǎng)和β細(xì)胞的分化及β細(xì)胞正常功能的維持起重要作用［3］。本研究采用CHIP-PCR技術(shù)比較小鼠胚胎干細(xì)胞（mouse embryonic stem cell，mES）、NIH小鼠成纖維細(xì)胞（NIH 3T3）和小鼠胰島素瘤β細(xì)胞（NIT-1）之間MafA基因轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的組蛋白修飾變化，以管家基因MLH1為對(duì)照，探討組蛋白修飾對(duì)MafA基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

（1）129/J小鼠胚胎干細(xì)胞（40 XY）和γ射線(xiàn)照射處理的第3代昆明小鼠胚胎成纖維細(xì)胞由賽業(yè)（廣州）生物科技有限公司提供。小鼠成纖維細(xì)胞株NIH3T3細(xì)胞和小鼠β細(xì)胞株NIT-1細(xì)胞由中山醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心細(xì)胞庫(kù)提供，上述兩細(xì)胞均來(lái)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)；（2）組蛋白H3K4三甲基化（histone 3 lysine 4 trimethylation，H3K4m3）抗體（Abcam）、組蛋白H3K9三甲基化（histone 3 lysine 9 trimethylation，H3K9m3）抗體（Abcam）、組蛋白H3乙?；贵w（Upstate）、抗小鼠Ig-G磁珠（BioLabs）；（3）超聲儀器Bioruptor（Diagenode）、Nanodrop（Agilent）、TaKaRa PCR Thermal Cycler（寶生生物工程有限公司）、ABI 7700 Realtime PCR儀（ABI）；（4）引物設(shè)計(jì)軟件：Primer 5.0。

1.2 細(xì)胞的準(zhǔn)備

1.2.1 mES細(xì)胞的培養(yǎng)：預(yù)先準(zhǔn)備由明膠包被的六孔板培養(yǎng)器皿，飼養(yǎng)層細(xì)胞是經(jīng)γ射線(xiàn)照射處理的第3代昆明小鼠胚胎成纖維細(xì)胞。加入解凍后的mES細(xì)胞懸液和129/J小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)基，在37℃、5％CO2、80％相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。復(fù)蘇后的第2天換用DMEM完全培養(yǎng)液，定期更換培養(yǎng)液，當(dāng)mES細(xì)胞克隆較大或克隆間出現(xiàn)融合時(shí)，予傳代。培養(yǎng)時(shí)間為2周。

1.2.2 NIT-1細(xì)胞的培養(yǎng)：將解凍后細(xì)胞懸液移入培養(yǎng)器皿中，加入足量的DMEM完全培養(yǎng)基，置于37℃、5％CO2、80％相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。復(fù)蘇后第2天更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)器皿80％后進(jìn)行傳代。培養(yǎng)時(shí)間為2周。

1.2.3 NIH 3T3細(xì)胞的培養(yǎng)：方法同NIT-1細(xì)胞。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 CHIP-PCR技術(shù)檢測(cè)組蛋白修飾

CHIP-PCR技術(shù)是研究蛋白與DNA之間在染色質(zhì)環(huán)境下相互作用的一種常用方法，用于檢測(cè)每個(gè)候選靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域是否存在能與組蛋白及特定轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的特定DNA序列。一般有兩種方法，一種是使用標(biāo)準(zhǔn)微球菌核酸酶來(lái)消化細(xì)胞核；另一種是在細(xì)胞中加入甲醛或?qū)⒓?xì)胞暴露在紫外射線(xiàn)使得染色質(zhì)發(fā)生交聯(lián)。接著用超聲波將染色質(zhì)切成300bp到1000bp之間的小片段，然后加入組蛋白修飾抗體以及偶聯(lián)Ⅱ抗磁珠進(jìn)行孵育反應(yīng)，利用磁鐵的吸引力將組蛋白修飾的DNA片段從待測(cè)樣品分離出來(lái)，采用酚-氯仿法純化DNA片段。最后用定量PCR法擴(kuò)增DNA片段，其擴(kuò)增產(chǎn)物的量即可反映該啟動(dòng)子區(qū)中組蛋白修飾水平。

1.3.1.1 組蛋白修飾檢測(cè)樣本的制備：將3種細(xì)胞（1×107個(gè)細(xì)胞/瓶）分別用胰酶消化，用Bioruptor進(jìn)行超聲處理后于2％瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見(jiàn)圖1。將斷裂后的DNA片段分成兩份，一份進(jìn)行免疫共沉淀反應(yīng)，一份作為input對(duì)照（不做任何處理直接進(jìn)行PCR反應(yīng)）。在第一份DNA樣品中其余依次加入組蛋白H3K4m3抗體（或組蛋白H3K9m3抗體，或組蛋白H3乙?；贵w）、G蛋白磁珠、抗小鼠IgG磁珠（磁珠偶聯(lián)Ⅱ抗），孵育后，緩沖液洗滌，去除未結(jié)合的DNA片段，蛋白酶K消化抗體，用酚-氯仿溶液進(jìn)行DNA純化后，Nanodrop測(cè)DNA濃度。

圖1 DNA超聲處理后電泳圖Fig.1 DNA after ultrasonic treatment Electrophoresis

1.3.1.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)擴(kuò)增目的基因啟動(dòng)子區(qū)：將3種細(xì)胞純化的DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。采用ABI 7700 Realtime PCR儀對(duì)免疫沉淀中MafA基因和MLH1基因的DNA、input control和陰性對(duì)照進(jìn)行擴(kuò)增。測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和熔解曲線(xiàn)，確保擴(kuò)增的準(zhǔn)確性和專(zhuān)一性，用Ct值表示樣品中模板的相對(duì)含量，數(shù)據(jù)采用2-△△CT法進(jìn)行分析。引物設(shè)計(jì)如下：MafA（mm9_cpgIslandExt_CpG：187.chr15：75576482-75578594.長(zhǎng)度185bp）：5′-CCTTGTACAGGTCCCGCTC-3′，5′-GGAGGTCATCC GACTGAAAC-3′；MLH1（mm9_cpgIslandExt_CpG：117.chr9：11117496 4-111175156.長(zhǎng)度193bp）：5′-TTAACCGAGCCAGGGACTTT-3′，5′-GCTTCCAG AATTGCCGACAT-3′。所有基因PCR程序一致，均如下：95℃、10min，40個(gè)PCR循環(huán)（95℃、15s，60℃、60s，收集熒光）。為了建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線(xiàn)，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，95℃、2min，60℃、20s，99℃、10s，并從60℃緩慢加熱到99℃，退火溫度59℃。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2 實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR：檢測(cè)3種細(xì)胞MafA和MLH1基因的表達(dá)水平。Trizol抽提RNA，鑒定RNA純度及定量后，RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以GAPDH基因作為內(nèi)參。設(shè)計(jì)引物序列如下：MafA：5′-AAAGCGGTGCTGGAGGAT-3′，5′-GGTTCAGGTG GTGCTGGTA-3′；MLH1：5′-GC GGTTAGTCGAGAAC TGATA-3′，5′-AGTGAACTTCGTGCTTGGTG-3′；GAP DH：5′-GTCCAT GCCATCACTGCCAC-3′，5′-ATGA CCTTGCCCACAGCCTT-3′。熒光定量PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件與前相同。測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和熔解曲線(xiàn)，確保擴(kuò)增的準(zhǔn)確性和專(zhuān)一性，用Ct值表示樣品中模板的相對(duì)含量，數(shù)據(jù)采用2-△△CT法進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS軟件13.0統(tǒng)計(jì)，采用單因素方差分析，兩兩比較則用t檢驗(yàn)，進(jìn)行相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 組蛋白修飾的檢測(cè)結(jié)果

用染色質(zhì)免疫共沉淀法檢測(cè)3種細(xì)胞中基因的組蛋白修飾的狀況。以mES細(xì)胞為參照，結(jié)果提示：NIT-1細(xì)胞中MafA基因轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的H3乙?；虷3K4m3修飾水平明顯增高（P＜0.05），H3K9m3修飾水平明顯降低（P＜0.05）；基因MLH1轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的H3乙?；揎椝浇档投鳫3K4m3修飾水平增高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在NIH 3T3細(xì)胞中，MafA基因轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的H3乙?；虷3K9m3修飾水平明顯增高（P＜0.05），H3K4m3修飾水平明顯降低（F=0.277，P=0.013）；管家基因MLH1轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的H3K9m3修飾水平增高（P＜0.05）（表1）。

表1 基因在不同細(xì)胞中組蛋白修飾的比較（±s，n=3）Tab.1 Gene histone modifications in different cells comparisons（±s，n=3）

表1 基因在不同細(xì)胞中組蛋白修飾的比較（±s，n=3）Tab.1 Gene histone modifications in different cells comparisons（±s，n=3）

注：a.P＜0.05與NIT-1細(xì)胞比較；b.P＜0.05與NIH3T3細(xì)胞比較Note：a.P＜0.05 vs NIT-1 cell.b.P＜0.05 vs NIH3T3 cell

組蛋白修飾 基因 小鼠胚胎干細(xì)胞 NIT-1細(xì)胞 NIH3T3細(xì)胞Histone modification Genes mES cell NIT-1 cell NIH3T3 cell H3乙酰化修飾水平（％） MafA 0.42±0.02a b 1.10±0.07 0.93±0.17 Levels of H3 acetylation acetylation modification（％） MLH1 2.47±0.35 1.91±0.29 1.69±0.19 H3K4m3修飾水平（％） MafA 1.69±0.14a，b 10.64±0.87 0.94±0.10 Levels of H3K4m3 modification（％） MLH1 8.37±0.49 12.91±1.63 7.87±1.41 H3K9m3修飾水平（％） MafA 0.17±0.003a.b 0.03±0.005 0.39±0.06 Levels of H3K9m3 modification（％） MLH1 0.66±0.06b 0.48±0.08 2.36±0.43

2.2 基因mRNA的表達(dá)水平

實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)基因表達(dá)，MafA在NIT-1細(xì)胞表達(dá)，而在NIH 3T3和mES細(xì)胞基本不表達(dá)，前者與后兩者存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。MLH1在3種細(xì)胞均表達(dá)，3者之間的表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表2）。

表2 基因在不同細(xì)胞中mRNA表達(dá)水平比較（±s，n=3）Tab.2 mRNA expression level of gene in different cells comparisons（±s，n=3）

表2 基因在不同細(xì)胞中mRNA表達(dá)水平比較（±s，n=3）Tab.2 mRNA expression level of gene in different cells comparisons（±s，n=3）

注：★P＜0.05 3者之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異Note：★P＜0.05 statistical differences among three type cells

基因 小鼠胚胎干細(xì)胞 NIT-1細(xì)胞 NIH3T3細(xì)胞Genes mES cell NIT-1 cell NIH3T3 cell MafA 4.89E-05±0.24E-05 4.72E-03±0.17E-03★1.15E-04±0.19E-04 MLH1 1.10E-03±0.22E-03 1.21E-03±0.27E-03 0.97E-03±0.25E-03

2.3 相關(guān)分析

對(duì)基因的組蛋白修飾和基因表達(dá)進(jìn)行相關(guān)分析。結(jié)果表明，MafA基因的表達(dá)與H3K4m3修飾存在直線(xiàn)相關(guān)（相關(guān)系數(shù)0.995，P＜0.01）；與H3K9m3修飾存在直線(xiàn)負(fù)相關(guān)（相關(guān)系數(shù)-0.751，P＜0.05），與H3乙?；揎棢o(wú)相關(guān)性。管家基因MLH1的表達(dá)與所檢測(cè)的組蛋白修飾無(wú)相關(guān)性。

3 討論

NIT-1細(xì)胞來(lái)源于NOD小鼠，是由SV40和大鼠胰島素基因的啟動(dòng)子經(jīng)轉(zhuǎn)基因方式產(chǎn)生永生化的β細(xì)胞系，具有與正常β細(xì)胞相似的基因表型，在葡萄糖的刺激下能夠分泌胰島素［4］。由于大量高純度的β細(xì)胞在獲取上存在困難，本實(shí)驗(yàn)采用NIT-1細(xì)胞代替正常β細(xì)胞作為研究對(duì)象。

組蛋白修飾是表觀(guān)遺傳學(xué)的重要組成部分，可在基因的DNA序列不發(fā)生改變時(shí)，使特異性基因的表達(dá)發(fā)生改變，并且這種改變還能通過(guò)有絲分裂和減數(shù)分裂進(jìn)行遺傳［5］。在機(jī)體中，細(xì)胞基本生命活動(dòng)所必需的管家基因可在各個(gè)細(xì)胞中表達(dá)；特異性基因MafA雖存在于所有的細(xì)胞，隨著胰腺的發(fā)育，其表達(dá)最終僅局限在β細(xì)胞［6］，提示組蛋白修飾可能參與其中的調(diào)控。

組蛋白有多種共價(jià)修飾方式，其中H3乙酰化、H3K4m3和H3K9m3是修飾基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要機(jī)制［7］。H3乙?；揎検笵NA與組蛋白間的靜電引力和空間位阻增大，兩者間的相互作用減弱，DNA易于解聚，染色質(zhì)呈轉(zhuǎn)錄活性結(jié)構(gòu)，進(jìn)而激活基因轉(zhuǎn)錄。H3K4m3使組蛋白和DNA的結(jié)構(gòu)由緊變松，靶基因才能和轉(zhuǎn)錄復(fù)合物相互作用，基因得以轉(zhuǎn)錄。H3K9m3能使組蛋白形成一個(gè)異染色質(zhì)蛋白HP1（heterochromatin protein 1）或其他抑制性染色質(zhì)因子的結(jié)合位點(diǎn)，HP1的結(jié)合進(jìn)而會(huì)導(dǎo)致DNA分子上特定CpG島的甲基化和穩(wěn)定的基因沉默。不同組蛋白修飾可依次發(fā)揮作用或組合在一起，形成一個(gè)修飾的級(jí)聯(lián)，它們通過(guò)協(xié)同或拮抗來(lái)共同發(fā)揮作用［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，MafA基因在mES、NIT-1和NIH 3T3三種細(xì)胞中的差異表達(dá)與H3K9m3修飾存在直線(xiàn)負(fù)相關(guān)；與H3K4m3修飾存在直線(xiàn)相關(guān)。MafA基因的表達(dá)與H3乙?；揎棢o(wú)相關(guān)性，這可能跟H3K9m3和H3乙?；揎梼烧唛g存在競(jìng)爭(zhēng)性有關(guān)［9］。而MLH1基因的表達(dá)與組蛋白修飾不存在相關(guān)性。結(jié)果表明，H3K9m3與H3K4m3修飾能協(xié)同作用于MafA基因轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，調(diào)控其表達(dá)。

MafA基因的表達(dá)可在β細(xì)胞分化的最后階段檢測(cè)到，其除了與Pdx-1和BE-TA2一起協(xié)同刺激胰島素基因表達(dá)［10］，還參與Pdx-1基因的表達(dá)調(diào)控，，是一個(gè)關(guān)鍵的基因特異性表達(dá)的調(diào)節(jié)器［11］。Zhao等［12］發(fā)現(xiàn)MafA基因敲除小鼠出生時(shí)的胰島在形態(tài)學(xué)上是正常的，但隨著年齡的增長(zhǎng)，小鼠表現(xiàn)為葡萄糖刺激胰島素分泌受損和胰島組織結(jié)構(gòu)的異常。可見(jiàn)，MafA基因與β細(xì)胞的分化密切相關(guān)。在胚胎干細(xì)胞分化過(guò)程中，隨著轉(zhuǎn)錄起始區(qū)H3K9m3與H3K4m3修飾水平的改變，MafA基因選擇性轉(zhuǎn)錄，胚胎干細(xì)胞能向β細(xì)胞定向分化；當(dāng)MafA基因選擇性失活時(shí)，胚胎干細(xì)胞則失去向β細(xì)胞定向分化的能力。因而，在胚胎干細(xì)胞向β細(xì)胞分化過(guò)程中，MafA基因的H3K4m3與H3K9m3修飾調(diào)控機(jī)制具有重要的作用。

綜上所述，H3K4m3與H3K9m3修飾能相互協(xié)調(diào)，共同調(diào)控MafA基因的表達(dá)，對(duì)胚胎干細(xì)胞向β細(xì)胞分化具有重要的意義。

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